हम एक विच्छेदन तकनीक का वर्णन करते हैं जो न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की वास्तुकला को संरक्षित करता है और वयस्क ड्रोसोफिला पैर में मोटर न्यूरॉन्स के विस्तृत इम्यूनोसाइटोकेमिकल अध्ययन को सक्षम बनाता है।
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर न्यूरोनल संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से सभ्य मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, और रोग राज्यों में बाद में परिवर्तन करता है। अच्छी तरह से विशेषता लार्वा न्यूरोमस्कुलर जंक्शन अक्सर इस तरह के अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, तेजी से लार्वा विकास के बाद मांसपेशियों के हिस्टोलिसिस और तंत्रिका तंत्र remodeling के दौरान कायापलट इस मॉडल को धीमी उम्र पर निर्भर अपक्षयी परिवर्तनों के अध्ययन के लिए समस्याग्रस्त बनाता है जैसे कि एमियोट्रोफिक पार्श्व स्क्लेरोसिस में होने वाले। वैकल्पिक रूप से, वयस्क मक्खियां 90 दिनों तक रहती हैं और वयस्क पैर का उपयोग छल्ली के माध्यम से विवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग में उपयोग करके वयस्क जीवनकाल के दौरान मोटर न्यूरॉन परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री के साथ मिलकर एक पैर विच्छेदन तकनीक का वर्णन करते हैं, जो पहचाने गए वयस्क पैर मोटर न्यूरॉन्स के न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर आणविक परिवर्तनों के अध्ययन की अनुमति देता है। इन तकनीकों को एंटीबॉडी के असंख्य के साथ जोड़ा जा सकता है जो पूर्व और बाद के सिनैप्टिक संरचनाओं दोनों को लेबल करता है। साथ में ये प्रक्रियाएं वयस्क मक्खियों में धीमी उम्र-निर्भर परिवर्तनों के अधिक पूर्ण लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं और कई मोटर न्यूरॉन रोग मॉडल में लागू की जा सकती हैं।
मोटर न्यूरॉन (एमएन) रोगों में विषम स्थितियों का एक समूह शामिल है जिसमें प्रगतिशील अध: पतन शामिल है जो प्राथमिक नैदानिक फेनोटाइप 1 के रूप में मांसपेशियों की बर्बादी और पक्षाघात के लिए अग्रणी है। हालांकि प्रति 100,000 प्रति 4.5 के वैश्विक प्रसार के साथ दुर्लभ, इस प्रसार को उम्र बढ़ने वाली आबादी के साथ बढ़ने की उम्मीद है2। एमियोट्रोफिक लेटरल स्केलेरोसिस (एएलएस) सबसे आम एमएन रोग (एमएनडी) है और आमतौर पर निदान के थोड़े समय के भीतर घातक होता है जिसमें कोई मौजूदा रोग-संशोधित उपचार उपलब्ध नहीं होता है। MNDs आम में जल्दी आणविक biomarker परिवर्तन और कार्यात्मक इमेजिंग रोगियों में देखा परिवर्तन के साथ एक लंबे समय तक presymptomatic चरण में साझा करते हैं4. प्रारंभिक presymptomatic सेलुलर विकृति भी गैर मानव रोग मॉडल 5,6,7,8 में मनाया जाता है। न्यूरोमस्कुलर जंक्शन पर शुरुआती परिवर्तनों का अध्ययन एमएन रोग रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और प्रारंभिक निदान और संभावित चिकित्सीय विकसित करने में सहायता कर सकता है।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन की संरचना और कार्य को विच्छेदित करने के लिए ड्रोसोफिला में आनुवंशिक और आणविक उपकरणों का एक खजाना मौजूद है (एनएमजे, अच्छी तरह से विशेषता वाले लार्वा एनएमजे की समीक्षा के लिए देखें 9)। ये उपकरण एक छोटे जीवनकाल के साथ संयुक्त ड्रोसोफिला को एनएमजे में न्यूरोडीजेनेरेटिव परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाते हैं। विशेष रूप से, एमएन इनरवेटिंग वयस्क मांसपेशियां ~ 90-दिवसीय वयस्क जीवनकाल में मौजूद होती हैं और सामान्य उम्र बढ़ने की प्रक्रियाओं के अधीन होती हैं10,11,12,13। वयस्क एमएन इसलिए लार्वा एनएमजे के विपरीत धीमी गति से अपक्षयी परिवर्तनों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करते हैं जो कायापलट 14,15 से पहले केवल एक छोटी ~ 1 सप्ताह की अवधि के लिए मौजूद हैं।
यहां, हम एक विच्छेदन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो हमें वयस्क पैर में एमएन के इम्यूनोसाइटोकेमिकल विश्लेषण का संचालन करने की अनुमति देता है। प्रत्येक वयस्क पैर को ~ 50 एमएन द्वारा इनरवेट किया जाता है, जो लोकोमोशन को चलाने के लिए संबंधित पैर की मांसपेशियों पर synapse करता है। पैर की शारीरिक रचना, यांत्रिक शरीर विज्ञान और न्यूरोबायोलॉजी को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है16,17,18। लेग एमएन के अक्षतंतु arbors को पहले द्विपक्षीय Gal4 / UAS प्रणाली का उपयोग करके बैक-भरे या आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए सेल आबादी में छल्ली के माध्यम से इमेजिंग की विशेषता दी गई है और इमेजिंग विधियों को पहले प्रकाशित किया गया है। यहां प्रस्तुत विच्छेदन विधियां अक्षतंतु शाखाओं के आकारिकी को संरक्षित करती हैं और हमें एनएमजे के विभिन्न आणविक घटकों को लेबल करने के लिए एंटीबॉडी की एक विविध श्रृंखला का शोषण करने की अनुमति देती हैं। हमारे पिछले काम ने मेटाथोरेसिक (3) पैर में एक परिभाषित एमएन के अनुमानों पर ध्यान केंद्रित किया है, जो टिबिया लेवेटर मांसपेशी (तिल्म) को इनरवेट करता है और लगातार आर्बराइजेशन पैटर्न और बाउटन संख्याओं को दिखाता है। प्रारंभ में हमने ड्रोसोफिला सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज 1 (dsod1) उत्परिवर्ती में उम्र-निर्भर परिवर्तनों का अध्ययन किया और NMJ20 को खत्म करने के अनुरूप परिवर्तन पाए। ये विच्छेदन विधियां अन्य एएलएस मॉडल, उम्र बढ़ने के बुनियादी अध्ययन और अन्य एमएन से संबंधित बीमारियों के लिए एनएमजे में धीमी गति से अपक्षयी परिवर्तनों को बेहतर ढंग से चिह्नित करने का अवसर प्रदान करती हैं।
चित्र 1. पैरों को विच्छेदन करने के लिए वर्कफ़्लो सारांश. विस्तृत चरणों के लिए प्रोटोकॉल देखें. (A, B) मक्खियों का चयन किया जाता है और एनेस्थेटिक किया जाता है। (c) मक्खियों को मेथनॉल में स्थानांतरित किया जाता है और पीबीएस के साथ धोया जाता है। (डी) मेटाथोरेसिक पैरों को कॉक्सा के आधार पर हटा दिया जाता है, जबकि एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप (~ 30x आवर्धन) के साथ कल्पना की जाती है; स्केल बार = 500 μm. (ई) पैरों को तब 24-अच्छी प्लेटों के कुओं के भीतर 30 मिनट के लिए 3.7% फॉर्मेल्डिहाइड / पीबीएस (एफए) समाधान में तय किया जाता है और फिर पीए को पीबीएस के साथ धोने से हटा दिया जाता है। (F, G, H) पैरों को सिलिकॉन इलास्टोमर विच्छेदन ट्रे में स्थानांतरित कर दिया जाता है और छल्ली का एक टुकड़ा समीपस्थ फीमर से 80x पर एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना करते हुए बेवेल संदंश का उपयोग करके हटा दिया जाता है; स्केल बार = 50 μm. (I) पैरों को एफए में तय किया जाता है और पीबीएस और फिर पीबीटी (पीबीएस + 0.1% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट) में धोया जाता है। (जे) पैरों को इम्यूनोसाइटोकेमिकल स्टेनिंग के अधीन किया जाता है। (K,L) पैरों को एक ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित किया जाता है, बढ़ते मीडिया में साफ किया जाता है, और मिट्टी के स्पेसर्स युक्त एक कवरस्लिप के साथ कवर किया जाता है; स्केल सलाखों = 2 मिमी और 500 μm. (एम) पैरों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
ड्रोसोफिला वयस्क पैर न्यूरोडीजेनेरेशन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है जो न्यूरोब्लास्ट वंशों और रूढ़िवादी आर्बराइजेशन पैटर्न से मैप किए गए अच्छी तरह से विशेषता वाले एमएन के साथ सापेक्ष सादगी को देखते हैं। कई रिपोर्टों ने पहले न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग 21,22 के अध्ययन के लिए पैर एमएन का उपयोग किया है। इन अध्ययनों ने छल्ली के माध्यम से छवि बनाने के लिए एक दमनकारी सेल मार्कर (MARCM) के साथ मोज़ेक विश्लेषण के साथ संयुक्त GFP-व्यक्त लाइनों का उपयोग किया और रूपात्मक परिवर्तनों की एक श्रृंखला का दस्तावेजीकरण किया। उच्छेदित छल्ली के साथ immunocytochemistry द्वारा इमेजिंग वयस्क NMJs उपलब्ध एंटीबॉडी के एक टूलबॉक्स का उपयोग करके जटिल आणविक परिवर्तनों को ट्रैक करने की क्षमता के साथ आगे लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल का इम्यूनोसाइटोकैमिस्ट्री भाग अपेक्षाकृत मानक है और इसे जीनोटाइप से स्वतंत्र रूप से लागू किया जा सकता है (ड्रोसोफिला के साथ उपयोग के लिए सामान्य एंटीबॉडी स्टेनिंग विधियों के उत्कृष्ट विवरण के लिए देखें23)। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति तीव्रता, अक्षतंतु शाखा की लंबाई, और बाउटन संख्या और आकार जैसे पैरामीटर विभिन्न प्रकार के उपलब्ध इमेजजे मैक्रोज़ का उपयोग करके निर्धारित किए जा सकते हैं एक बार छवियों पर कब्जा कर लिया जाता है और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विस्तृत तरीके प्रकाशित किए जाते हैं (उदाहरण के लिए, देखें24,25,26)। इस प्रकार, विच्छेदन तकनीक यहां वर्णित मुख्य नवाचार है। विच्छेदन से पहले, मक्खियों को क्यूटिकुलर हाइड्रोकार्बन को स्ट्रिप करने के लिए एक अल्कोहल में डुबोया जाता है। इथेनॉल और मेथनॉल दोनों का उपयोग आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए किया जाता है; हालांकि, हमने केवल मेथनॉल का उपयोग किया है। विच्छेदन सफलता के लिए महत्वपूर्ण कई कारक हैं: सबसे पहले, बेवल के साथ संशोधित संदंश का उपयोग करना छल्ली के साथ बहुत सतही संपर्क की अनुमति देता है। दूसरा, 60-100x कुल आवर्धन में सक्षम एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना ताकि छल्ली की सतह स्पष्ट रूप से दिखाई दे। कम अधिकतम आवर्धन वाले माइक्रोस्कोप के लिए, 2x उद्देश्य सबसे आम ब्रांडों के लिए उपलब्ध हैं और मौजूदा लेंस के साथ संयुक्त होने पर पर्याप्त होना चाहिए। तीसरा, प्रारंभिक निर्धारण चरण छल्ली भंगुर बनाता है और नीचे की मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना दूर खींचना आसान बनाता है। इस चरण में ओवर-फिक्सेशन पूरे पैर को प्रभावी विच्छेदन के लिए बहुत कठोर बनाता है। इसलिए, प्रारंभिक निर्धारण 30 मिनट तक सीमित होना चाहिए। फॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेटिव इस छोटी अवधि के दौरान अंतर्निहित ऊतक को प्रभावी ढंग से क्रॉसलिंक करने के लिए पर्याप्त प्रवेश नहीं करेगा और इस प्रकार एक दूसरा निर्धारण चरण आवश्यक है। दूसरे निर्धारण से पहले, ऊतकों को आकारिकी में गिरावट और परिवर्तन को रोकने के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। चौथा, हमने नमूनों को विच्छेदन पाया है जबकि ठंड भी महत्वपूर्ण है, संभवतः इसी तरह के कारणों से उस छल्ली भंगुर है और एक छोटे से टुकड़े को अधिक आसानी से हटाया जा सकता है।
अभ्यास के साथ, हम पाते हैं कि ~ 50% विच्छेदन कोई समझदार ऊतक क्षति के भीतर उपयोग करने योग्य होगा। हालांकि यह प्रतिशत कुछ अन्य ऊतकों के सापेक्ष कम लग सकता है, विच्छेदन प्रक्रिया तेज है, और कई पैरों को 30-60 मिनट में संसाधित किया जा सकता है। इसलिए, भले ही सफलता की दर शुरू में कम हो, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के लिए 4-5 अच्छे नमूने प्राप्त करना संभव है। हालांकि, एक सीमा किसी भी समय उपलब्ध मक्खियों की संख्या हो सकती है यदि जीनोटाइप और / या उम्र के परिणामस्वरूप पर्याप्त घातकता होती है।
एक और सीमा यह है कि हम आकार के कारण फीमर के समीपस्थ क्षेत्र से परे पैर के अन्य क्षेत्रों को विच्छेदित करने में सक्षम नहीं हैं। इस प्रकार, हम टीआईएलएम को मज़बूती से इनरवेट करने वाले पहचाने गए एमएन आर्बर्स का अध्ययन कर सकते हैं और विच्छेदन करते समय पैर को उन्मुख करने के तरीके में छोटे बदलावों के साथ टिबिया डिप्रेसर मांसपेशी के ऊपर छल्ली को विच्छेदित करना संभव है। हालांकि, विच्छेदन के दौरान चेताक्षीय वास्तुकला को बाधित किए बिना पैर के अन्य क्षेत्रों तक पहुंचना अधिक कठिन साबित हुआ है।
यहां, हम वयस्क एनएमजे में परिवर्तनों का पता लगाने के लिए विच्छेदन विधियों को प्रस्तुत करते हैं, जो परिभाषित एमएन के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके तिल्म को इनरवेट करते हैं। पैर एक सरल प्रणाली के रूप में उपयोगी है, केवल ~ 50 एमएन द्वारा अंतर्निहित है और अच्छी तरह से वर्णित शरीर रचना विज्ञान के साथ 14 मांसपेशियों से युक्त है। विच्छेदित पैर की तैयारी का उपयोग जीनोटाइप में किया जा सकता है और उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में रिपोर्टर जीन निर्माणों के जीनोटाइपिक रूप से जटिल स्टॉक के निर्माण की आवश्यकता के बिना एनएमजे विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एंटीबॉडी का एक सूट उपलब्ध है। यह दृष्टिकोण एमएन रोगों और अन्य उम्र से संबंधित स्थितियों के लिए एनएमजे में परिवर्तनों के अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन को सक्षम करेगा।
The authors have nothing to disclose.
हम इमेजिंग पर सलाह के लिए एरिक रॉबर्ट्स को धन्यवाद देते हैं। हम रोड आइलैंड कॉलेज में सूचना प्रौद्योगिकी सेवाओं और विशेष रूप से माइकल केन और जेक डगलस को वीडियोग्राफी के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एंटी-डीएलजी और एंटी-बीआरपी क्रमशः यूसी-बर्कले और Universitaetsklinikim Wuerzburg द्वारा विकसित किए गए थे, और विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किए गए थे, जो एनआईएच के एनआईसीएचडी द्वारा बनाया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए 52242, संयुक्त राज्य अमेरिका में बनाए रखा गया था। यहां रिपोर्ट किए गए शोध को रोड आइलैंड इंस्टीट्यूशनल डेवलपमेंट अवार्ड (आईडीईए) नेटवर्क ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस द्वारा अनुदान संख्या [P20GM103430] के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय चिकित्सा विज्ञान संस्थान से पूरी तरह से समर्थित किया गया था।
10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |