JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi av extracellulära blåsor i tre dimensioner

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) används för att kringgå den typiska diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi och för att visa exosomer på nanometerskalan. Det kan användas i både två och tre dimensioner för att karakterisera exosomer.

Abstract

Extracellulära blåsor (EVs) frigörs av alla celltyper och spelar en viktig roll i cellsignalering och homeostas. Visualiseringen av EVs kräver ofta indirekta metoder på grund av deras lilla diameter (40-250 nm), vilket ligger under diffraktionsgränsen för typisk ljusmikroskopi. Vi har utvecklat en mikroskopibaserad visualisering av EL-apparater med superupplösning för att kringgå diffraktionsgränsen i både två och tre dimensioner. Med den här metoden kan vi lösa den tredimensionella formen av EVs till inom +/- 20 nm upplösning på XY-axeln och +/- 50 nm upplösning längs Z-axeln. Sammanfattningsvis föreslår vi att superupplösningsmikroskopi betraktas som en karakteriseringsmetod för EVs, inklusive exosomer, samt höljevirus.

Introduction

Extracellulära blåsor (EVs) är membranbundna blåsor som frigörs av alla celltyper. De innehåller lipider, proteiner, metaboliter och nukleinsyror och överför dessa material lokalt mellan celler och distally mellan vävnader och organ. Det finns tre primära undertyper av EVs: apoptotiska kroppar, mikrovesicles och exosomer1,2. Här fokuserar vi vår diskussion på exosomer och deras tillhörande proteiner.

Exosomer är utsöndrade blåsor som härrör från inåtgående spirande av tidiga endosomer i den multivesikulära kroppen (MVB). MVB smälter sedan samman med plasmamembranet och släpper ut exosomerna i det extracellulära utrymmet för att resa till andra celler3,4. Exosomer finns på ett spektrum av storlekar från 40 till 150 nm och är berikade med endosomala transmembranproteiner som kallas tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbunden endosomal sorteringskomplex som krävs för transporten (ESCRT) och lipidflotteassocierade proteiner1,2,5,6,7.

Att karakterisera exosomernas biokemiska sammansättning har blivit ett populärt område för forskare att bättre förstå deras funktionella natur. Många metoder finns för att visualisera och karakterisera exosomer, inklusive nanoskala flöde cytometri, nanopartikelspårningsanalys (NTA), skannings- och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ytplasmonresonans, resistiv pulsavkänning och traditionell ljusmikroskopi, som var och en innehåller inneboende fördelar och nackdelar8,9. TEM och cryo-EM kan uppnå nanometerbaserad upplösning, men kräver ofta uttorkning och frysfraktursteg och därmed krymper eller lysar EVs10,11. NTA förlitar sig på ljusspridning, vilket möjliggör karakterisering av hundratals EVs åt gången, men är en indirekt mätning av partikelstorlek och kan inte enkelt skilja mellan EVs, virus och proteinaggregat12,13,14,15,16. Nanoskala flöde cytometri använder ljusspridning från en excitationsväg, som sedan kan översättas till storleksmätningar, men är en framväxande teknik, och det finns lite konsensus om vilken storlek på partiklar som ligger inom det linjära detektionsområdet för olika instrument12,17,18.

Traditionell ljusmikroskopi med fluorescerande proteiner eller färgämnen har varit en av de mest använda teknikerna för att visualisera subcellulära fack, proteinkomplex och signalmaskiner i en cell. Medan denna teknik visar sig användbar för att visualisera lokalisering av komplex, förhindrar diffraktionsgränsen för traditionell ljusmikroskopi (cirka 250-400 nm) den tydliga upplösningen av proteiner eller strukturer i det typiska storleksområdet för en exosom (40-150 nm)12,19,20.

Superupplösningsmikroskopi, nämligen direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM), skiljer sig från konventionell ljusmikroskopi genom att använda de fotowitchable egenskaperna hos specifika fluoroforer och upptäcka dessa blinkande händelser för att rekonstruera bilder ner till nanometerprecision21. Fotowitching händelser samlas in med hjälp av en hög-framerate detekteringskamera under loppet av tiotusentals individuella exponeringar, och en punktspridningsfunktion används för att med hög säkerhet kartlägga den exakta platsen för den fotowitching fluorophore19,20,22. Detta gör det möjligt för dSTORM att kringgå diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Flera grupper har rapporterat användningen av superupplösningstekniker för att visualisera och spåra exosomer och deras associerade proteiner22,23,24,25. Den slutliga upplösningen beror på fluoroforens biofysiska egenskaper, men sträcker sig ofta från +/-10-100 nm längs XY-axeln, vilket möjliggör enmolekylsupplösning.

Förmågan att lösa enskilda fluoroforer i denna skala på XY-axeln har revolutionerat mikroskopi. Det finns dock lite data om den tredimensionella (3D) dSTORM av en exosom. Därför försökte vi upprätta ett standardförfarande (SOP) för dSTORM-baserad visualisering och karakterisering av renade EVs, inklusive exosomer till nanometerprecision i 3D.

Protocol

1 Spridning och underhåll av cellinjer Förvärva humana osteosarkomceller (U2OS) och placera cellerna i tillväxtmediet kompletterat med 10% exosomfritt fetalt bovinserum och 1x Penicillin/Streptomycin lösning.OBS: Exosomfria fetala nötkreatur serum genererades efter protokollet presenteras i McNamara et. al.26. Håll U2OS-cellerna i en kopparbelagd inkubator vid 37 °C i 5% CO2 och passageceller i T175-flaskorna26,<sup clas…

Representative Results

Målet med denna studie var att utvärdera effektiviteten av superupplösningsmikroskopi vid visualisering av enskilda EVs med nanometerupplösning i tre dimensioner (3-D). För att analysera formen och storleken på enskilda EVs använde vi fotowitchable färgämne och inkuberade EVs med ett långt rött, membran intercalating färgämne och tog bort överflödigt färgämne genom kromatografi29. Affinitet-fångade anti-CD81 och röd-färgade EVs visades sedan i superupplösning mikroskop under 6…

Discussion

EVs har blivit ett populärt studieområde på grund av deras viktiga roll i många intracellulära processer och cell-till-cell-signalering1,30. Deras visualisering visar sig dock vara svår eftersom deras lilla storlek faller under diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) är en direkt visualiseringsmetod som kringgår diffraktionsgränsen genom att fånga fotowitching händelser av enskilda fluorofor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka Oxford Nanoimaging för deras konstruktiva feedback och vägledning. Detta arbete finansierades av 5UM1CA121947-10 till R.P.M. och 1R01DA040394 till D.P.D.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

Extracellular VesiclesDSTORMSuper-resolution MicroscopyThree-dimensional VisualizationVirus ParticlesDisease BiomarkersAffinity PurificationParaformaldehyde FixationImaging BufferCalibration Beads
check_url/kr/62845?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image