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생물학

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) viene utilizzata per bypassare il limite di diffrazione tipico della microscopia ottica e per visualizzare gli esosomi su scala nanometrica. Può essere impiegato sia in due che in tre dimensioni per caratterizzare gli esosomi.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) vengono rilasciate da tutti i tipi di cellule e svolgono un ruolo importante nella segnalazione cellulare e nell’omeostasi. La visualizzazione dei veicoli elettrici richiede spesso metodi indiretti a causa del loro piccolo diametro (40-250 nm), che è al di sotto del limite di diffrazione della tipica microscopia ottica. Abbiamo sviluppato una visualizzazione basata sulla microscopia a super-risoluzione dei veicoli elettrici per aggirare il limite di diffrazione in due e tre dimensioni. Usando questo approccio, possiamo risolvere la forma tridimensionale dei veicoli elettrici entro la risoluzione di +/- 20 nm sull’asse XY e la risoluzione di +/- 50 nm lungo l’asse Z. In conclusione, proponiamo che la microscopia a super-risoluzione sia considerata come un metodo di caratterizzazione dei veicoli elettrici, compresi gli esosomi, così come i virus avvolti.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono vescicole legate alla membrana rilasciate da tutti i tipi di cellule. Contengono lipidi, proteine, metaboliti e acidi nucleici e trasferiscono questi materiali localmente tra le cellule e distalmente tra tessuti e organi. Esistono tre sottotipi principali di veicoli elettrici: corpi apoptotici, microvescicole ed esosomi1,2. Qui, concentriamo la nostra discussione sugli esosomi e le loro proteine associate.

Gli esosomi sono vescicole secrete provenienti dal germogliamento verso l’interno dei primi endosomi nel corpo multivesicolare (MVB). L’MVB si fonde quindi con la membrana plasmatica, rilasciando gli esosomi nello spazio extracellulare per viaggiare verso altre cellule3,4. Gli esosomi esistono su uno spettro di dimensioni che va da 40 a 150 nm e sono arricchiti con proteine transmembrana endosomiali note come tetraspanine (CD9, CD63, CD81), complesso di selezione endosomiale legato alla membrana necessario per il trasporto (ESCRT) e proteine associate a zattere lipidiche1,2,5,6,7.

Caratterizzare la composizione biochimica degli esosomi è diventato un campo popolare per i ricercatori per comprendere meglio la loro natura funzionale. Esistono molti metodi per visualizzare e caratterizzare gli esosomi, tra cui la citometria a flusso su scala nanometrica, l’analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la microscopia elettronica a scansione e trasmissione (TEM), la risonanza plasmonica di superficie, il rilevamento di impulsi resistivi e la microscopia ottica tradizionale, ognuno dei quali contiene pro e contro intrinseci8,9. TEM e cryo-EM possono raggiungere una risoluzione basata su nanometri, ma spesso richiedono fasi di disidratazione e congelamento-frattura, riducendo o lisando così i veicoli elettrici10,11. NTA si basa sulla diffusione della luce, consentendo la caratterizzazione di centinaia di veicoli elettrici alla volta, ma è una misura indiretta della dimensione delle particelle e non può facilmente distinguere tra EV, virus e aggregati proteici12,13,14,15,16. La citometria a flusso su scala nanometrica impiega la diffusione della luce da un percorso di eccitazione, che può quindi essere tradotto in misurazioni delle dimensioni, ma è una tecnologia emergente, e c’è poco consenso su quale dimensione delle particelle siano all’interno del range lineare di rilevamento per vari strumenti12,17,18.

La microscopia ottica tradizionale che utilizza proteine fluorescenti o coloranti è stata una delle tecniche più utilizzate per visualizzare compartimenti subcellulari, complessi proteici e macchinari di segnalazione all’interno di una cellula. Mentre questa tecnica si rivela utile nella visualizzazione della localizzazione di complessi, il limite di diffrazione della microscopia ottica tradizionale (circa 250-400 nm) impedisce la chiara risoluzione di proteine o strutture nell’intervallo di dimensioni tipiche di un esosoma (40-150 nm)12,19,20.

La microscopia a super-risoluzione, ovvero la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM), si distingue dalla microscopia ottica convenzionale impiegando le proprietà fotocommutabili di specifici fluorofori e rilevando questi eventi lampeggianti per ricostruire le immagini fino alla precisione nanometrica21. Gli eventi di photoswitching vengono raccolti utilizzando una telecamera di rilevamento ad alto framerate nel corso di decine di migliaia di esposizioni individuali e viene utilizzata una funzione di diffusione puntuale per mappare con elevata sicurezza la posizione esatta del fluoroforofotoregistratore 19,20,22. Ciò consente a dSTORM di aggirare il limite di diffrazione della microscopia ottica. Diversi gruppi hanno riportato l’uso di tecniche di super-risoluzione per visualizzare e tracciare gli esosomi e le loro proteine associate22,23,24,25. La risoluzione finale dipende dalle proprietà biofisiche del fluoroforo, ma spesso varia da +/-10-100 nm lungo l’asse XY, consentendo la risoluzione a singola molecola.

La capacità di risolvere singoli fluorofori su questa scala sull’asse XY ha rivoluzionato la microscopia. Tuttavia, ci sono pochi dati sul dSTORM tridimensionale (3-D) di un esosoma. Pertanto, abbiamo cercato di stabilire una procedura operativa standard (SOP) per la visualizzazione e la caratterizzazione basate su dSTORM di veicoli elettrici purificati, inclusi gli esosomi con precisione nanometrica in 3D.

Protocol

1 Propagazione e manutenzione delle linee cellulari Acquisire cellule di osteosarcoma umano (U2OS) e posizionare le cellule nel mezzo di crescita integrato con siero bovino fetale privo di esosomi al 10% e 1 soluzione di penicillina / streptomicina.NOTA: Il siero bovino fetale privo di esosomi è stato generato seguendo il protocollo presentato in McNamara et. al.26. Mantenere le celle U2OS in un incubatore rivestito di rame a 37 °C nel 5% di CO2 e le celle di p…

Representative Results

L’obiettivo di questo studio era valutare l’efficacia della microscopia a super-risoluzione nella visualizzazione di singoli veicoli elettrici con risoluzione nanometrica in tre dimensioni (3-D). Per analizzare la forma e le dimensioni dei singoli veicoli elettrici, abbiamo impiegato un colorante fotointercabilibile e incubato i veicoli elettrici con un colorante intercalante a membrana di colore rosso lontano e rimosso il colorante in eccesso attraverso la cromatografia29. I veicoli elettrici ant…

Discussion

I veicoli elettrici sono diventati un’area di studio popolare a causa del loro importante ruolo in molti processi intracellulari e nella segnalazione da cellula a cellula1,30. Tuttavia, la loro visualizzazione si rivela difficile in quanto le loro piccole dimensioni scendono al di sotto del limite di diffrazione della microscopia ottica. La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) è un metodo diretto di visualizzazione che aggira il limite …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Oxford Nanoimaging per il loro feedback costruttivo e la guida. Questo lavoro è stato finanziato dal 5UM1CA121947-10 a R.P.M. e dal 1R01DA040394 al D.P.D.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
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