Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær saccharomyces cerevisiae
Summary
På trods af de seneste fremskridt, mange gær mitokondrie proteiner stadig med deres funktioner helt ukendt. Denne protokol giver en enkel og pålidelig metode til at bestemme underkastelsesalisering af proteiner, som har været grundlæggende for udredningen af deres molekylære funktioner.
Abstract
På trods af de seneste fremskridt i karakteriseringen af gær mitokondrie proteom, er indsendelsenokondrial lokalisering af et betydeligt antal proteiner stadig undvigende. Her beskriver vi en robust og effektiv metode til bestemmelse af suborganellar lokalisering af gær mitokondrieproteiner, som betragtes som et grundlæggende skridt under mitokondrieproteinfunktionsudredning. Denne metode indebærer et første skridt, der består i at opnå meget ren intakt mitokondrier. Disse mitokondriepræparater underkastes derefter en subfraktioneringsprotokol bestående af hypotonchok (hævelse) og inkubation med proteinase K (protease). Under hævelse forstyrres den ydre mitokondriemembran selektivt, så proteinase K kan fordøje proteiner i intermembranumrummet. Parallelt, for at få oplysninger om topologien af membranproteiner, bliver mitokondriepræparaterne oprindeligt sonikeret og udsættes derefter for alkalisk ekstraktion med natriumcarbonat. Endelig, efter centrifugering, pellet og supernatant fraktioner fra disse forskellige behandlinger analyseres af SDS-PAGE og vestlige blot. Den submitochondriale lokalisering samt membranen topologi af protein af interesse opnås ved at sammenligne sin vestlige blot profil med kendte standarder.
Introduction
Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der spiller afgørende roller i bioenergetik, cellulære metabolisme, og signalering veje1. For korrekt at udføre disse opgaver er mitokondrier afhængige af et unikt sæt proteiner og lipider, der er ansvarlige for deres struktur og funktion. Den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er blevet meget brugt som et modelsystem til undersøgelser af mitokondrieprocesser samt til andre organeller2. Mitokondriegenomkoderne for kun otte proteiner i gær; langt de fleste mitokondrieproteiner (~99%) er kodet af nukleare gener, som oversættes på cytosoliske ribosomer og efterfølgende importeres til deres korrekte indsendelsesrum af avancerede proteinimportmaskiner3,4,5. Mitokondriebiogenese afhænger således af det koordinerede udtryk for både det nukleare og mitokondriegenomer6,7. Genetiske mutationer forårsager defekter i mitokondrie biogenese er forbundet med menneskelige sygdomme8,9,10.
I de sidste to årtier, high-throughput proteomiske undersøgelser rettet mod stærkt renset mitokondrier resulterede i en omfattende karakterisering af gær mitokondrie proteom, som er blevet anslået til at bestå af mindst 900 proteiner11,12,13,14. Selv om disse undersøgelser gav værdifulde oplysninger, er suborganellar lokalisering af hvert protein i de fire mitokondrie subcompartments, nemlig den ydre membran (OM), intermembrane rum (IMS), indre membran (IM) og matrix, stadig påkrævet. Dette spørgsmål blev delvis behandlet med proteomiske undersøgelser af de to mindre mitokondrieunderkomplekser (OM og IMS)15,16. For nylig tog Vögtle og samarbejdspartnere et stort skridt fremad ved at generere et globalt kort af høj kvalitet over indsendelse af proteiner i gær. Ved hjælp af en integreret tilgang, der kombinerer SILAC-baseret kvantitativ massespektrometri, forskellige submitochondriale fraktioneringsprotokoller og datasættet fra OM- og IMS-proteomerne, tildelte forfatterne 818 proteiner i de fire mitokondrieunderkommandoer13.
På trods af de fremskridt, der er opnået ved disse højgennemsigtede proteomiske undersøgelser, er vores viden om indsendelsesproktørrieproteomsammensætningen langt fra afsluttet. Faktisk, blandt 986 proteiner rapporteret af Vögtle og samarbejdspartnere som værende lokaliseret til gær mitokondrier, 168 kunne ikke tildeles i nogen af de fire submitochondrial rum13. Desuden gav forfatterne ikke oplysninger om membranetopologien af proteiner, der blev forudsagt at være perifert fastgjort til periferien af mitokondriemembraner. For eksempel er det ikke muligt at vide, om et protein, der blev tildelt som perifert fastgjort til den indre membran, vender mod matrixen eller intermembranrummet. Bortset fra disse manglende data fra proteom-dækkende undersøgelser, der er modstridende oplysninger om suborganellar lokalisering af et betydeligt antal mitokondrie proteiner. Et eksempel er protease Prd1, som er blevet tildelt som et intermembrane rumprotein i de fælles databaser som Saccharomyces Genome Database (SGD) og Uniprot. Overraskende nok viste Vögtle og samarbejdspartnere ved hjælp af en underfraktioneringsprotokol svarende til den, der er beskrevet her, klart, at Prd1 er et ægte matrixprotein13. Som nævnt ovenfor skal indsendeokondrial lokalisering af mange mitokondrieproteiner belyses eller revurderes. Her giver vi en enkel og pålidelig protokol til bestemmelse af suborganellar lokalisering af gær mitokondrieproteiner. Denne protokol blev udviklet og optimeret af forskellige forskningsgrupper og er rutinemæssigt blevet brugt til at bestemme underkastelsesplaceringen samt membrantopologien af mange mitokondrieproteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, er blevet brugt med succes og løbende optimeret i lang tid til at bestemme proteinaaliseringen i indsenderokondrierummene13,14,18,21,22,23. Pålideligheden og reproducerbarheden af denne protokol er stærkt afhængig af renheden og integriteten af mitokondriepræparater18.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) for at give antistoffer rejst mod submitochondrial markør proteiner Cyt. b2, αKGD og Sco1. Vi takker også Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) for nyttige diskussion og kommentarer under oprettelsen af denne protokol.
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (tilskud 2013/07937-8).
Fernando Gomes og Helena Turano støttes også af FAPESP, giver henholdsvis 2017/09443-3 og 2017/23839-7. Angélica Ramos støttes også af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Materials
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast extract | BD | 212750 | |
| Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bovine serum albumin (BSA fatty acid free) | Sigma-Aldrich | A7030 | Component of Homogenization buffer |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | Component of DDT buffer |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used to inactivate proteinase K |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma-Aldrich | T6399 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, Irvine, CA | 320921 | Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
- Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
- Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
- Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
- Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
- Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
- Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
- Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
- Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
- Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
- Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
- Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).
- Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
- Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
- Vögtle, F. -. N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
- Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
- Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
- Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
- Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
- Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).
- Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463 (2016).
- Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484 (2016).
- Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
- Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
- Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).
