Fremstilling av multifunksjonelle silkebaserte mikrokapsler lastet med DNA-plasmider som koder for RNA-aptamere og riboswitcher
Summary
Protokollen beskriver dannelsen av robuste og biokompatible DNA-ladede mikrokapsler som multipleksede in vitro biosensorer som er i stand til å spore flere ligander.
Abstract
Vi introduserer en protokoll for fremstilling av DNA-lastede silkefibroinmikrokapsler via Layer-by-Layer (LbL) monteringsmetode på offersfæriske kjerner. Etter adsorpsjon av et primærlag og DNA-plasmider ble dannelsen av robuste mikrokapsler lettere ved å indusere β-ark i silkens sekundærstruktur under akutt dehydrering av et enkelt silkelag. Derfor skjedde lagdelingen via flere hydrogenbindinger og hydrofobe interaksjoner. Ved adsorpsjon av flerlagsskall kan kjerneskallstrukturene funksjonaliseres ytterligere med gullnanopartikler (AuNP) og / eller antistoffer (IgG) som skal brukes til fjernmåling og / eller målrettet levering. Justering av flere nøkkelparametere under sekvensiell avsetning av viktige makromolekyler på silikakjerner som tilstedeværelsen av en polymerprimer, konsentrasjonen av DNA og silkeprotein, samt en rekke adsorberte lag, resulterte i biokompatible, DNA-ladede mikrokapsler med variabel permeabilitet og DNA-belastninger. Ved oppløsning av silikakjerner demonstrerte protokollen dannelsen av hule og robuste mikrokapsler med DNA-plasmider immobilisert til kapselmembranens indre overflate. Å skape en selektivt permeabel biokompatibel membran mellom DNA-plasmidene og det ytre miljø bevarte DNA under langvarig lagring og spilte en viktig rolle i den forbedrede utgangsresponsen fra romlig begrensede plasmider. Aktiviteten til DNA-maler og deres tilgjengelighet ble testet under in vitro transkripsjon og translasjonsreaksjoner (cellefrie systemer). DNA-plasmider som koder for RNA light-up aptamere og riboswitcher ble vellykket aktivert med tilsvarende analytter, som ble visualisert under lokalisering av fluorescerende merkede RNA-transkripter eller GFPa1-protein i skallmembranene.
Introduction
Feltet syntetisk biologi gir unike muligheter til å utvikle sensing evner ved å utnytte naturlige mekanismer utviklet av mikroorganismer for å overvåke deres miljø og potensielle trusler. Det er viktig at disse sensingmekanismene vanligvis er knyttet til et svar som beskytter disse mikroorganismer mot skadelig eksponering, regulerer genuttrykk for å redusere negative effekter eller forhindre inntak av giftige materialer. Det har vært betydelig innsats for å konstruere disse mikroorganismene for å skape helcellesensorer som utnytter disse naturlige responsene, men omdirigerer dem til å gjenkjenne nye mål og / eller å produsere et målbart signal som kan måles for kvantifiseringsformål (typisk fluorescens) 1,2. For tiden er bekymringer med bruk av genetisk modifiserte mikroorganismer (GMO), spesielt når de slippes ut i miljøet eller menneskekroppen, på grunn av lekkasje av hele celler eller noe av deres genetiske materiale, selv om de er innkapslet i en polymermatrise, at alternative måter å utnytte disse sensing-tilnærmingene er nødvendig3.
En kraftig tilnærming for å utnytte fordelene med mikroorganismebasert sensing uten bekymring for distribusjon av GMO, er bruk av in vitro transkripsjon / oversettelse (IVTT) systemer. Fra et praktisk perspektiv består IVTT-systemer av en blanding som inneholder de fleste cellekomponentene i en aktiv tilstand som har blitt “ekstrahert” fra celler på forskjellige måter, inkludert sonikering, perleslag eller andre4. Det endelige produktet av denne prosessen er en biokjemisk reaksjonsblanding som allerede er optimalisert for å utføre transkripsjon og oversettelse som kan brukes til å teste forskjellige sensorer i et “åpent fartøy” -format, uten begrensninger forbundet med bruk av hele celler (membrandiffusjon, transformasjonseffektivitet, celletoksisitet, etc.). Det er viktig at forskjellige sensorkomponenter kan legges kvantitativt til, og deres effekt studeres ved forskjellige optiske og spektrometriske teknikker, som vi har demonstrert5. Det har blitt lagt merke til at ytelsen til IVTT-systemer kan være inkonsekvent; Nylige studier har imidlertid vist tilnærminger for å standardisere deres forberedelse og karakterisering, noe som er til stor hjelp når man studerer ytelsen i sensordesign6. Nylig har mange eksempler på IVTT-systemer som brukes til å lage papirbaserte analyser gjennom lyofilisering av komponentene i papirmatriser, blitt demonstrert, inkludert påvisning av tungmetallioner, stoffer, quorumsfølende elementer og andre 7,8,9. Et spennende bruksområde for IVTT-baserte sensorer er deres bruk i sensorapplikasjoner i forskjellige typer miljøer, inkludert jord, vann og menneskekroppen. For å distribuere disse IVTT-systemene til disse utfordrende miljøene, må en innkapslingsmetode implementeres for å inneholde IVTT-komponentene og beskytte dem mot nedbrytning.
De vanligste innkapslingsmetodene for IVTT-systemer inkluderer bruk av lipidkapsler, miceller, polymersomer og andre tett lukkede mikrobeholdere10,11,12. En ulempe med denne tilnærmingen er behovet for å innlemme enten passive eller aktive mekanismer for å transportere materialer inn og ut av beholderne for å tillate kommunikasjon med det ytre miljø og gi sensing evner. For å overvinne noen av disse problemene, rapporterer studien her en metode som gir en enkel, men effektiv tilnærming til å kapsle inn kodingsmaterialene for forskjellige sensordesign som skal uttrykkes i IVTT-systemer. Denne tilnærmingen er basert på bruk av lag-for-lag (LbL) avsetning av en biopolymer i nærvær av plasmider av interesse for å skape hule mikrokapsler med høy porøsitet, noe som gjør at det beskyttede genetiske materialet kan interagere med de forskjellige komponentene i IVTT av valg. Studien viste at innkapslede plasmider kunne lede transkripsjon og oversettelse når de ble aktivert i denne polymere matrisen, som vist med responsen av en plasmidkodet aptamer og en riboswitch til deres tilsvarende mål. I tillegg beskytter dette LbL-belegget plasmidene i flere måneder uten spesielle lagringsforhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektivt permeable hydrogelmikrokapsler lastet med ulike typer DNA-kodede sensordesign kan fremstilles etter denne protokollen. Et av de karakteristiske trekkene ved LbL-tilnærmingen er evnen til å skreddersy kompleksiteten til mikrokapsler under bottom-up-monteringen, som vanligvis starter med adsorpsjon av molekylære arter på offermaler. Ved nøye justering av konsentrasjoner av de opprinnelige komponentene, pH-forhold og antall lag, kan mikrokapsler med forskjellige DNA-belastningsparametere, funksjonalitet og ju…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av LRIR 16RH3003J-tilskudd fra Air Force Office of Scientific Research, samt Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S &T Priorities (ARAP) -programmet til US Office of the Under Secretary of Defense for Research and Engineering.
Plasmidvektorsekvensen for ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3,4 kb) ble sjenerøst levert av Dr. J. Gallivan. Silkeormkokonger fra Bombyx mori ble sjenerøst donert av Dr. DL Kaplan fra Tufts University, MA.
Materials
| (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-2-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-imidazol-5(4 H)-one (DFHBI-1T) | Lucerna | DFHBI-1T | |
| 5x T4 DNA Ligase Buffer | ThermoFisher Scientific | 46300-018 | |
| 6x Blue Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7021S | |
| 96-well plates, black circular | Corning | 3601 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | BioReagent, for molecular biology, low EEO |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | powder or crystals, BioReagent, suitable for cell culture |
| BlpI restriction enzymes | New England BioLabs | R0585S | |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | FisherScientific | 09-761-1 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | ACS reagent, ≥99.9% |
| DNA Plasmid, pET28c-F30-2x Broccoli (5.4 kb), BrocApt. | Addgene | Plasmid #66788 | |
| DyLightTM550 Antibody Labeling kit (Invitrogen) | ThermoFisher Scientific | 84530 | |
| E. coli S30 extract system for circular DNA | Promega | L1020 | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL | FisherScientific | 14-959-53A | |
| Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL | 14-432-22 | ||
| Fisherbrand Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | FisherScientific | 05-408-129 | |
| Hydrofluoric acid, HF | Sigma-Aldrich | 695068 | ACS reagent, 48% |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | mixture of Kanamycin A (main component) and Kanamycin B and C |
| KpnI restriction enzymes | New England BioLabs | R0142S | |
| LB agar plate supplemented with 100 µg/mL ampicillin | Sigma-Aldrich | L5667 | pre-poured agar plates with 100 µg/mL ampicillin |
| LB agar plate supplemented with 50 µg/mL kanamycin | Sigma-Aldrich | L0543 | pre-poured agar plates with 50 µg/mL kanamycin |
| LB broth (Lennox grade) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Lithium bromide, LiBr | Sigma-Aldrich | 213225 | ReagentPlus, ≥99% |
| Max Efficiency DH5-α competent E. coli strain | ThermoFisher Scientific | 18258012 | |
| Methanol | MilliporeSigma | 322415 | anhydrous, 99.8% |
| MilliQ-water | EMD MilliPore | Milli-Q Reference Water Purification System | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC | Sigma-Aldrich | E1769 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | 1x PBS, pH 7.4 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | average Mw ~25,000 |
| PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit | New England BioLabs | E6800S | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb) | New England BioLabs | N0469S | |
| SiO₂ silica microspheres, 4.0 µm | Polysciences, Inc. | 24331-15 | 10% aqueous solution |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 15 mL | ThermoFisher Scientific | 87724 | |
| Sodium carbonate, Na₂CO₃ | Sigma-Aldrich | 222321 | ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder |
| Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Dialysis Devices | FisherScientific | 08-607-008 | Spectrum G235058 |
| SYBR Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633 | anhydrous, ≥99%, powder |
| Tris Acetate-EDTA buffer (TAE buffer) | Sigma-Aldrich | T6025 | Contains 40 mM Tris-acetate and 1 mM EDTA, pH 8.3. |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | FisherScientific | 10-977-023 | |
| ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep kit | ZymoResearch | D4202 |
References
- Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).
- Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. Riboswitch-based reversible dual-color sensor. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).
- König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns. Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).
- Chushak, Y., et al. Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- Grӓwe, A., et al. A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs. PLoS One. 14 (3), 0210940 (2019).
- Lin, X., et al. Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems. RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).
- Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes. Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications. Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).
- Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus. Scientific Reports. 4, 5469 (2014).
- Frey, B., Reischl, U. Amplification of Genomic DNA by PCR. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine. 13, 143-156 (1998).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Zhou, Y., et al. Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits. Scientific Reports. 8, 12870 (2018).
- Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), 0137466 (2015).
- Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).
- Drachuk, I., et al. Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells. ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).
- Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability. Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).
- Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).
- Zhao, S., et al. The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald. ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).
- Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research. APL Bioengineering. 5, 031504 (2021).
- Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy. Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).
- Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans. Scientific Reports. 8, 7046 (2018).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction. Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).
- Ge, X., Luo, D., Xu, J. Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions. PLoS One. 6 (12), 28707 (2011).
- Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays. Nature Communications. 11, 1283 (2020).
- Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
