Denne protokol beskriver, hvordan man inficerer menneskelige intestinale organoider fra enten deres apikale eller basolaterale side for at karakterisere værts /patogeninteraktioner på enkeltcelleniveau ved hjælp af encellet RNA-sekventering (scRNAseq) teknologi.
Humane intestinale organoider udgør den bedste cellulære model til at studere patogeninfektioner i mave-tarmkanalen. Disse organoider kan udledes af alle dele af MAVE-tarmkanalen (gastrisk, jejunum, duodenum, ileum, kolon, endetarmen) og, efter differentiering, indeholder de fleste af de celletyper, der er naturligt findes i hver enkelt sektion. For eksempel indeholder intestinale organoider næringsabsorberende enterocytter, sekretoriske celler (Pokal, Paneth og enteroendokrine), stamceller samt alle slægtsspecifikke differentierings mellemprodukter (f.eks. tidlige eller umodne celletyper). Den største fordel ved at anvende mave-tarmkanalen-afledte organoider til at studere smitsomme sygdomme er muligheden for præcist at identificere, hvilken celletype der er målrettet af det enteriske patogen, og at tage fat på, om de forskellige dele af mave-tarmkanalen og deres specifikke celletyper på samme måde reagerer på patogenudfordringer. I løbet af de seneste år er gastrointestinale modeller, såvel som organoider fra andre væv, blevet anvendt til at studere viral tropofi og patogenesemekanismerne. Men at udnytte alle fordelene ved at bruge organoider, når man anvender højpatogene vira, udgør en teknisk udfordring og kræver strenge overvejelser om biosikkerhed. Derudover, som organoider ofte dyrkes i tre dimensioner, den basolaterale side af cellerne vender ydersiden af organoid, mens deres apikale side vender indersiden (lumen) af organoider. Denne organisation udgør en udfordring for enteriske patogener, da mange enteriske infektioner indleder fra den apikale / lysende side af cellerne efter indtagelse. Følgende manuskript vil give en omfattende protokol til at forberede menneskelige intestinale organoider til infektion med enteriske patogener ved at overveje infektionssiden (apikale vs basolateral) til at udføre encellet RNA sekventering for at karakterisere celle-type-specifikke vært / patogen interaktioner. Denne metode beskriver forberedelsen af organoiderne samt de overvejelser, der er nødvendige for at udføre dette arbejde under biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) indeslutningsbetingelser.
At studere celletypespecifik tropoisme og celletypespecifik immunrespons på humane enteriske vira har været historisk udfordrende på grund af manglen på primære menneskelige cellulære modeller. Denne begrænsning er nu delvist udryddet med udviklingen af organoider1. I tilfælde af mave-tarmkanalen er der udviklet gastriske og intestinale organoidmodeller til mennesker og flere andre arter (f.eks.murin, kvæg, katte, flagermus)2,3,4,5,6. Tarmorganoider reproducerer den strukturelle arkitektur i det menneskelige tarmepitele og indeholder krypt- og villi-lignende strukturer, funktionelle tarmledninger og er endda blevet brugt til at identificere hidtil ukendte celleledninger. To forskellige tilgange kan bruges til at dyrke tarmorganoider. For det første isoleres tarmstamceller, der indeholder krypter, fra vævsresektioner eller biopsier og dyrkes under særlige kulturforhold (f.eks. Wnt3A, R-spondin, Noggin og EGF) for at udvide og derefter differentiere stamcellerne til de fleste tarmcellestammer (f.eks. enterocytter, Paneth-celler, Pokalceller, enteroendokrine celler)7. Denne metode giver mulighed for isolering af organoider fra alle dele af mave-tarmkanalen (f.eks.,mave, duodenum, jejunum, ileum og tyktarm). Den anden metode er afhængig af menneskeskabte pluripotente eller embryonale stamceller, som derefter differentieres i en trinvis proces i tarmepileleceller8. Disse inducerede stamcellebaserede organoider beskrives ofte som værende mere embryonale i naturen sammenlignet med patientafledte organoider. Mens alle disse organoid modeller har været afgørende for at optrævle udviklingsmæssige signaler er nødvendige for at danne tarmkanalen, deres anvendelse i infektionssygdomme forskning er stadig i sin vorden.
Enterisk virus er et bredt begreb, der dækker alle vira, som inficerer gennemmave-tarmkanalen, såsom picornavirus (f.eks. , EV-71), reovirus (f.eks. rotavirus) og calicivirus (f.eks. norovirus)9. Enteriske vira indleder deres smitsomme livscyklus gennem indtagelse af forurenet mad og vand, hvilket efterlader mennesker i udviklingslandene i høj risiko på grund af udledning af ubehandlet affald i miljøet og mangel på lægehjælp efter infektionens begyndelse10. Afhængigt af typen af patogen, infektionen kan føre til gastroenteritis, opkastning, og / eller vandig diarré på grund af lækage af tarmforing. Human norovirus er en meget udbredt og meget smitsom enterisk patogen, der fører til over 600 millioner infektioner og 15 millioner indlæggelser på verdensplan11. Organoider har været nøglen til norovirus forskning, da de understøtter infektion og replikation af human norovirus, som tidligere ikke var i stand til at blive kultiveret i standard cellekultur modeller12.
I løbet af de sidste to årtier har coronavirus vist sig som centrale menneskelige patogener13. Denne familie omfatter den højpatogene MERS, SARS-CoV-1 og SARS-CoV-2, som kræver strenge sikkerhedsniveau indeslutninger, når de udfører forskning på disse vira. Interessant nok, mens alle tre af disse patogener for det meste er anerkendt for deres inducerede luftvejssymptomer og nød, er det nu tydeligt, at disse vira ikke udelukkende inficerer luftvejene, men også andre organer. En vigtig patologi induceret hos SARS-CoV-2 inficerede patienter udover åndedrætsbesvær er tilstedeværelsen af gastrointestinale symptomer14. En brøkdel af SARS-CoV-2 inficerede patienter viser sådanne symptomer, lige fra meget mild til svær diarré. Derudover kan SARS-CoV-2 genomer påvises i afføring og mave-tarmkanalen biopsier af inficerede patienter15. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af mave-tarm-symptomer ikke er begrænset til SARS-CoV-2, da de også blev observeret hos MERS- og SARS-CoV-1-inficerede patienter. For at forstå, hvordan SARS-CoV-2 fremkalder mave-tarm-nød og præcist identificerer tropism af SARS-CoV-2 i mave-tarmkanalen, har menneskelige tarmorganoider været et centralt redskab og udnyttes nu til at optrævle celletypespecifikke reaktioner på dette patogen16,17.
Transskriptionel profilering af en cellepopulation (bulk RNA sekventering) har været standard praksis, når man vurderer patogeninfektioner af både udødeliggjorte cellelinjer samt med organoider. Mens dette giver os mulighed for at bestemme globale ændringer som reaktion på patogener (f.eks upregulation af cytokiner), bulk RNAseq ikke giver os mulighed for at afgøre, hvorfor specifikke celler i en befolkning er mere tilbøjelige til infektion end andre. Single-cell RNA sekventering (scRNAseq) er blevet et kraftfuldt værktøj til at optrævle celle afstamning-specifikke transskriptionsprogrammer og kan bruges til at bestemme, hvordan disse programmer understøtter eller undertrykke virusinfektion18,19. Den første beskrivelse af scRNAseq var i 2009 og blev brugt til at evaluere transskriptionsprofilerne for de forskellige celler, der findes i en muse blastomere20. Disse teknologier er nu blevet udvidet og kan implementeres gennem flere forskellige platforme. Tidlige versioner af denne teknologi anvendte fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til at adskille individuelle celler til sekventering, som ofte var begrænset til 96- eller 384-brøndplader, hvilket gav 300 individuelle celler til at analysere pr. prøve21. Disse metoder er nu blevet avanceret af enkeltcellede sekventeringsplatforme, som bruger en mikrofluidisk enhed til at indkapsle enkelte celler i individuelle dråber med stregkode indeholdende perler. Denne teknologi gør det muligt at fange op til 10.000 celler pr. prøvetilstand.
Ved at kombinere organoider teknologi med scRNAseq giver os mulighed for at studere, hvordan enteriske patogener påvirker mave-tarmkanalen på en celle type-specifik måde. Der er dog behov for flere tekniske og biosikkerhedsmæssige overvejelser. Først og fremmest udsætter klassiske organoider kulturmetoder (3-dimensionelle (3D) organoider, indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM)) den basolaterale side af epitelcellerne for ydersiden af organoiden. Som enteriske patogener indlede deres infektion gennem indtagelse af forurenet mad / vand, infektionen oftest indleder fra den apikale side af cellerne, som ikke er tilgængelig i disse 3D intestinale organoider. Derfor skal organoider være forberedt på at gøre den apikale side tilgængelig for patogeninfektion enten gennem 2D-såning og derved direkte udsætte den apikale side af cellerne eller gennem mikroinjektion22,23. For det andet, at udføre scRNAseq af inficerede biologiske prøver, er det vigtigt at overveje deres smitsomme natur. Mens metoder til at fastsætte celler og inaktivere patogener forud for encellet isolation for efterfølgende RNAseq er blevet foreslået, fører disse metoder ofte til et fald i sekventeringskvalitet18. Nedenstående protokol vil beskrive flere tilgange til at inficere tarmorganoider med enteriske vira i betragtning af infektionssiden (apisk vs. basolateral infektion) (Figur 1). Derudover vil protokollen omfatte en arbejdsgang for at adskille og isolere enkelte celler fra organoider inficeret med højpatogene vira for scRNAseq. Protokollen vil fremhæve de vigtigste trin, der skal gennemføres, når der arbejdes under BSL-3 -indeslutningsbetingelserne (biosikkerhedsniveau-3) for at undgå generering af aerosoler og potentiel forurening.
Enteriske patogener starter oftest deres livscyklus ved at inficere tarmepileleceller fra deres apikale side mod tarmens lumen. Mens organoider er velkendte for at være en god model til at reproducere den cellulære kompleksitet og organisering af tarmepitele, gør deres organisation som tredimensionelle, lukkede strukturer deres apikale membran utilgængelig for patogenet. Denne protokol beskrev metoder til at inficere intestinale organoider fra deres apikale side, deres basolaterale side, eller begge med BLS-3 patogener. Disse protokoller kan nemt tilpasses til at studere ethvert enterisk patogen under BSL-2 eller BLS-3 indeslutning eller enhver anden organoid model ved at følge et par kritiske trin, der er fremhævet nedenfor. Den ovenfor beskrevne metode er til isolering og tilberedning af enkeltcellede dråber i overensstemmelse med reglerne i Tyskland. Som en ansvarsfraskrivelse beskriver denne protokol ikke de biosikkerhedshåndteringsforanstaltninger (standardprocedurer), der skal træffes, mens du arbejder under BSL-3-betingelser. Det er også vigtigt at insistere på, at reglerne kan variere i andre lande, og at de lokale myndigheder skal kontaktes for at sikre, at alle lokale bestemmelser overholdes.
Et af de kritiske trin i såning organoider i to dimensioner for apikal infektion er at kontrollere, at cellerne vil ligeledes differentiere sig i forhold til, når de dyrkes som klassiske tre-dimensionelle organoider. Afhængigt af det enteriske patogen kan tropoisme begrænses til meget sjældne celler eller til celler, der skal være meget differentierede. I dette tilfælde kan brug af en todimensionel organoid, der ikke fuldt ud differentierede, resultere i den fejlagtige aftale om, at dette enteriske patogen ikke kan inficere tarmorganoider. Det foreslås, hvis det er muligt, at udføre infektioner ved hjælp af de tre konfigurationer af denne protokol: 2D organoid til apisk infektion kun (afsnit 2), revnede åbne 3D organoider til apikal og basolateral infektion (afsnit 3) og fulde 3D organoider til basolateral infektion kun (afsnit 3). Denne tilgang vil bidrage til at skelne patogenets indgangsvej (apikal vs. basolateral) og vil også kontrollere, at der er opnået et lignende differentieringsniveau. Et alternativ til 2D-apikal infektion er mikroinjektion, som vil bruge en 3D-organoid, men levere patogenet direkte ind i den apikale side (se Bartfeld et al.27 for detaljer). Denne metode kræver en dygtig injektor for at sikre, at patogenet er korrekt placeret, og organoiderne forbliver intakte. Microinjection er almindeligt anvendt i BSL-2 indeslutning og kan ikke være egnet til BSL-3 indeslutning.
En yderligere vigtig overvejelse, når man udfører infektionsforsøg i 2D-seedede organoider, er den endelige celletæthed. Som nævnt i trin 2.3, vil 100-150 organoider blive sået i en brønd af en 48-brønd plade eller en brønd af en 8-brønd glas-bund kammer slide. Afhængigt af organoidlinjen og på den person, der håndterer organoiderne, kan størrelsen af disse organoider være betydeligt forskellig. Dette kan resultere i meget forskellige celletætheder i 48-brøndspladen eller 8-brønd glasbundet kammerrutschebane. Afhængigt af den enteriske virus foretrækker nogle vira mere sparsomme celler, mens andre også vil være i stand til at inficere sammenløbsceller. Den molekylære oprindelse af sådanne forskelle i infektionsevne for forskellige celle sammenløb er ikke klar; Pilotforsøg, der har til formål at finde den bedste celletæthed for det valgte enteriske patogen, bør derfor udføres, inden der udføres yderligere downstream-karakterisering.
Ofte FCS sortering udføres forud for udførelsen af enkeltcellet dråbe emulsion. Dette trin bruges ofte til at adskille døde fra levende celler og enkelte celler fra doublets. Når du arbejder med BSL-3 patogener, kræver det, at anlægget er udstyret med en passende FACS-sortering, hvilket ikke ofte er tilfældet. Desuden har ikke alle celler i en organoid samme størrelse, og det er ofte svært at skelne mellem en dobbelt eller en større celle, hvilket forårsager en risiko for negativt at vælge mod en bestemt celletype. Der er også stadig diskussion på området, om den tid, der er nødvendig for sortering mellem 5.000-10.000 for hver prøve, kan resultere i en betydelig ændring af udskriftsprofilen for de enkelte celler. Mens cellefikseringsmetoder, der er kompatible med encellesekvensering (f.eks. methanol og RNAassist), er blevet beskrevet, blev det observeret, at dette fører til et fald i kvaliteten af sekventering18. Endelig er der mistanke om, at sortering af celler ved hjælp af celledødsmarkører også kan føre til en bias. I betragtning af den retningsbestemt spredning og differentiering af cellerne gennem krypt-villi aksen, de mest differentierede celler, som vil blive kastet og frigivet, er placeret på spidsen af villi. Disse celler er ofte positive for forskellige markører for celledødsveje (f.eks. apoptose, nekrose og nekrose); men når man ser på rotavirus infektion i musen tarm, spidsen af villi er den mest inficerede område28. Således filtrere celler, der kan se positive for død markører ville resultere i en negativ udvælgelse af de inficerede celler, der kan repræsentere den fysiologiske infektion. I øjeblikket er der ingen god løsning til sortering og fastsættelse af organoider før enkeltcellet sekventering. Brug af levende, usorterede celler anbefales, da yderligere undersøgelser er nødvendige for at finde egnede alternative protokoller.
Sekvensering med en enkelt celle har revolutioneret, hvordan cellulære svar kan evalueres. Denne teknik giver mulighed for identifikation af celle afstamningsspecifikke reaktioner både under basale forhold og under patogeninfektioner. Denne metode har åbnet døre på mange områder, der tidligere var begrænset af masseudlæsninger. Mens denne metode er meget kraftfuld, har den sine begrænsninger. En vigtig begrænsning er den omfattende bioinformatiske analyse, der kræves nedstrøms af sekventering. Dette er især nøglen, når du analyserer væv og tildeler celletyper, hvor der i øjeblikket ikke er nogen anmærkning. At have en dygtig bioinformatiker er nødvendig for at støtte alle encellede undersøgelser.
Denne protokol beskriver, hvordan man frø og håndtere menneskelige intestinale organoider, inficere dem med enteriske patogener, og udføre scRNAseq. Tilpasning af denne tilgang til andre organer er nu mulig, da organoide modelsystemer er blevet udviklet til de fleste organer. Lunge- og leverorganoider er ligeledes organiseret i forhold til tarmorganoider, og som sådan kan ved hjælp af en analog tilgang overføres til disse organoider. Den kritiske kontrol vil være at validere, at når de dyrkes i to dimensioner eller revnet åben, opnår disse organoider lignende differentiering som deres 3D-organoide modstykker. De specifikke træk og gener, der definerer en differentieret status, er specifikke for hver organmodel. Andre organoid modeller såsom nyre og vaskulære organoider, store tætte strukturer, vil have brug for yderligere metoder til serielt at adskille disse strukturer i enkelte celler.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer og Steeve Boulant blev støttet af forskningsbevillinger fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Projektnummer 240245660, 278001972, 415089553 og 272983813 til Steeve Boulant og 416072091 til Megan Stanifer), staten Baden-Württemberg og Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B til MS og 01KI20198A og (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) til SB. Skemaer blev oprettet i BioRender.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |