Denne protokollen beskriver hvordan man infiserer humane tarmorganoider fra enten deres apikale eller basolaterale side for å karakterisere verts- / patogeninteraksjoner på encellet nivå ved hjelp av encellet RNA-sekvenseringsteknologi (scRNAseq).
Humane intestinale organoider utgjør den beste cellulære modellen for å studere patogeninfeksjoner i mage-tarmkanalen. Disse organoidene kan avledes fra alle deler av GI-kanalen (mage, jejunum, duodenum, ileum, kolon, endetarm) og, ved differensiering, inneholder de fleste celletyper som naturlig finnes i hver enkelt seksjon. For eksempel inneholder intestinale organoider næringsabsorberende enterocytter, sekretoriske celler (beger, paneth og enterokendokrine), stamceller, samt alle avstamningsspesifikke differensieringsformidlere (f.eks. tidlige eller umodne celletyper). Den største fordelen ved å bruke mage-tarmkanalen-avledede organoider for å studere smittsomme sykdommer er muligheten for nøyaktig å identifisere hvilken celletype som er målrettet av det enteriske patogenet og å adressere om de forskjellige delene av mage-tarmkanalen og deres spesifikke celletyper på samme måte reagerer på patogenutfordringer. I løpet av de siste årene har gastrointestinale modeller, så vel som organoider fra andre vev, blitt brukt til å studere viral tropisme og mekanismene for patogenese. Imidlertid representerer bruk av alle fordelene ved å bruke organoider når du bruker svært patogene virus en teknisk utfordring og krever strenge biosikkerhetshensyn. I tillegg, som organoider ofte dyrkes i tre dimensjoner, vender den basolaterale siden av cellene mot utsiden av organoiden mens deres apikale side vender mot organoidenes indre (lumen). Denne organisasjonen utgjør en utfordring for enteriske patogener ettersom mange enteriske infeksjoner initierer fra den apikale / lysende siden av cellene etter inntak. Følgende manuskript vil gi en omfattende protokoll for å forberede humane intestinale organoider for infeksjon med enteriske patogener ved å vurdere infeksjonssiden (apikal vs. basolateral) for å utføre encellet RNA-sekvensering for å karakterisere celletypespesifikke verts- / patogeninteraksjoner. Denne metoden beskriver forberedelsen av organoidene samt hensynene som trengs for å utføre dette arbeidet under biosikkerhetsnivå 3 (BSL-3) inneslutningsforhold.
Det har vært historisk utfordrende å studere celletypespesifikk tropisme og celletypespesifikk immunrespons på humane enteriske virus på grunn av mangel på primære humane cellulære modeller. Denne begrensningen er nå delvis utryddet med utviklingen av organoider1. Når det gjelder mage-tarmkanalen, er mage- og tarmorganoidmodeller utviklet for mennesker og flere andre arter(f.eks. murin, bovin, feline, bat)2,3,4,5,6. Intestinale organoider reproduserer den strukturelle arkitekturen til det menneskelige tarmepitelet og inneholder krypt- og villi-lignende strukturer, funksjonelle tarmavstamninger og har til og med blitt brukt til å identifisere tidligere ukjente celleavstamninger. To forskjellige tilnærminger kan brukes til å vokse intestinale organoider. For det første er tarmstammer celler som inneholder krypter isolert fra vev reseksjoner eller biopsier og vokst under spesifikke kulturforhold (f.eks. Wnt3A, R-spondin, Noggin og EGF) for å utvide, og deretter skille stamcellene til de fleste tarmcelleavstamninger(f.eks. enterocytter, Paneth-celler, Goblet-celler, enterodokrine celler)7. Denne metoden tillater isolering av organoider fra alle deler avmage-tarmkanalen (f.eks. mage, tolvfingertarmen, jejunum, ileum og kolon). Den andre metoden er avhengig av menneskeskapte pluripotente eller embryonale stamceller, som deretter differensieres i en trinnvis prosess i tarmepitelceller8. Disse induserte stamcellebaserte organoidene beskrives ofte som mer embryonale i naturen sammenlignet med pasientavledede organoider. Mens alle disse organoidmodellene har vært avgjørende for å avdekke utviklingssignaler som trengs for å danne tarmkanalen, er deres bruk i smittsom sykdomsforskning fortsatt i sin spede begynnelse.
Enterisk virus er et bredt begrep som dekker alle virus, som infiserer gjennom mage-tarmkanalen, for eksempel picornavirus (f.eks. , EV-71), reovirus (f.eks. rotavirus) og calicivirus (f.eks. norovirus)9. Enteriske virus initierer sin smittsomme livssyklus gjennom inntak av forurenset mat og vann, noe som etterlater folk i utviklingsland med høy risiko på grunn av utslipp av ubehandlet avfall i miljøet og mangel på medisinsk behandling etter infeksjonsde begynnelse10. Avhengig av type patogen, kan infeksjonen føre til gastroenteritt, oppkast og / eller vannaktig diaré på grunn av lekkasje av tarmforingen. Menneskelige norovirus er et svært utbredt og svært smittsomt enterisk patogen, som fører til over 600 millioner infeksjoner og 15 millioner sykehusinnleggelser over hele verden11. Organoider har vært nøkkelen til norovirusforskning da de støtter infeksjon og replikasjon av humant norovirus, som tidligere ikke var i stand til å bli dyrket i standard cellekulturmodeller12.
I løpet av de siste to tiårene har koronavirus dukket opp som viktige menneskelige patogener13. Denne familien inkluderer den svært patogene MERS, SARS-CoV-1 og SARS-CoV-2, som krever strenge sikkerhetsnivå inneslutninger når du utfører forskning på disse virusene. Interessant, mens alle disse tre patogenene for det meste er anerkjent for sine induserte luftveissymptomer og nød, er det nå tydelig at disse virusene ikke bare smitter luftveiene, men også andre organer. En viktig patologi indusert hos SARS-CoV-2 infiserte pasienter i tillegg til luftveiene er tilstedeværelsen av gastrointestinale symptomer14. En brøkdel av SARS-CoV-2 infiserte pasienter viser slike symptomer, alt fra svært mild til alvorlig diaré. I tillegg kan SARS-CoV-2 genomer påvises i avføring og mage-tarmkanalen biopsier av infiserte pasienter15. Viktig tilstedeværelsen av gastrointestinale symptomer er ikke begrenset til SARS-CoV-2 da de også ble observert hos MERS og SARS-CoV-1 infiserte pasienter. For å forstå hvordan SARS-CoV-2 induserer gastrointestinal nød og nøyaktig identifiserer tropismen til SARS-CoV-2 i mage-tarmkanalen, har humane tarmorganoider vært et nøkkelverktøy og utnyttes nå til å avdekke celletypespesifikke responser på dette patogenet16,17.
Transkripsjonell profilering av en cellepopulasjon (bulk RNA-sekvensering) har vært standard praksis ved evaluering av patogeninfeksjoner i både udødelige cellelinjer så vel som med organoider. Selv om dette gjør det mulig for oss å bestemme globale endringer som svar på patogener (f.eks. oppregulering av cytokiner), tillater ikke bulk RNAseq oss å bestemme hvorfor spesifikke celler i en populasjon er mer utsatt for infeksjon enn andre. Encellet RNA-sekvensering (scRNAseq) har blitt et kraftig verktøy for å løse opp cellelinjespesifikke transkripsjonsprogrammer og kan brukes til å bestemme hvordan disse programmene støtter eller undertrykker virusinfeksjon18,19. Den første beskrivelsen av scRNAseq var i 2009 og ble brukt til å evaluere transkripsjonsprofilene til de forskjellige cellene som finnes i en mus blastomere20. Disse teknologiene er nå utvidet og kan implementeres gjennom flere forskjellige plattformer. Tidlige versjoner av denne teknologien brukte fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å skille individuelle celler for sekvensering, som ofte var begrenset til 96- eller 384-brønnsplater, og dermed ga 300 individuelle celler å analysere per prøve21. Disse metodene har nå blitt avansert av encellede sekvenseringsplattformer, som bruker en mikrofluidisk enhet for å innkapsle enkeltceller i individuelle dråper med strekkode som inneholder perler. Denne teknologien gjør det mulig å fange opp opptil 10 000 celler per prøvebetingelse.
Ved å kombinere organoider teknologi med scRNAseq kan vi studere hvordan enteriske patogener påvirker mage-tarmkanalen på en celletypespesifikk måte. Det må imidlertid tas flere tekniske og biosikkerhetshensyn. Først og fremst eksponerer klassiske organoider kulturmetoder (3-dimensjonale (3D) organoider, innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM)) den basolaterale siden av epitelcellene på utsiden av organoiden. Når enteriske patogener initierer infeksjonen gjennom inntak av forurenset mat / vann, initierer infeksjonen oftest fra den apikale siden av cellene, som ikke er tilgjengelig i disse 3D-tarmorganoidene. Derfor må organoider være forberedt på å gjøre den apikale siden tilgjengelig for patogeninfeksjon enten gjennom 2D-såing, og dermed direkte utsette den apikale siden av cellene, eller gjennom mikroinjeksjon22,23. For det andre, for å utføre scRNAseq av infiserte biologiske prøver, er det viktig å vurdere deres smittsomme natur. Mens metoder for å fikse celler og inaktivere patogener før encellet isolasjon for etterfølgende RNAseq er foreslått, fører disse metodene ofte til en reduksjon i sekvenseringskvalitet18. Protokollen nedenfor vil beskrive flere tilnærminger for å infisere tarmorganoider med enteriske virus med tanke på infeksjonssiden (apikal vs. basolateral infeksjon) (Figur 1). I tillegg vil protokollen inkludere en arbeidsflyt for å dissosiere og isolere enkeltceller fra organoider infisert med svært patogene virus for scRNAseq. Protokollen vil fremheve de viktigste trinnene som må implementeres når du arbeider under biosikkerhet nivå-3 (BSL-3) inneslutningsbetingelser for å unngå generering av aerosoler og potensiell forurensning.
Enteriske patogener initierer oftest livssyklusen ved å infisere intestinale epitelceller fra deres apikale side vendt mot tarmens lumen. Mens organoider er godt anerkjent for å være en god modell for å reprodusere den cellulære kompleksiteten og organiseringen av tarmepitelet, gjør deres organisasjon som tredimensjonale, lukkede strukturer deres apikale membran utilgjengelig for patogenet. Denne protokollen beskrev metoder for å infisere intestinale organoider fra deres apikale side, deres basolaterale side, eller begge deler med BLS-3 patogener. Disse protokollene kan enkelt tilpasses for å studere ethvert enterisk patogen under BSL-2 eller BLS-3 inneslutning eller en annen organoidmodell ved å følge noen få kritiske trinn som er uthevet nedenfor. Metoden beskrevet ovenfor er for isolering og forberedelse av encellede dråper i samsvar med regelverket i Tyskland. Som ansvarsfraskrivelse beskriver ikke denne protokollen de biosikkerhetshåndteringstiltakene (standard driftsprosedyrer) som må tas under arbeid under BSL-3-forhold. Det er også viktig å insistere på at regelverket kan variere i andre land og at kommunene må kontaktes for å sikre at alle lokale forskrifter blir respektert.
Et av de kritiske trinnene i såing organoider i to dimensjoner for apikal infeksjon er å kontrollere at celler vil tilsvarende skille sammenlignet med når de vokser som klassiske tredimensjonale organoider. Avhengig av det enteriske patogenet, kan tropisme begrenses til svært sjeldne celler eller til celler som må være svært differensiert. I dette tilfellet kan bruk av en todimensjonal organoid som ikke helt differensierer, føre til feilslutning om at dette enteriske patogenet ikke kan infisere tarmorganoider. Det foreslås, om mulig, å utføre infeksjoner ved hjelp av de tre konfigurasjonene av denne protokollen: 2D organoid kun for apikal infeksjon (avsnitt 2), sprakk åpne 3D-organoider for apikal og basolateral infeksjon (avsnitt 3), og bare fulle 3D-organoider for basolateral infeksjon (avsnitt 3). Denne tilnærmingen vil bidra til å skjelne inngangsruten til patogenet (apikalt vs. basolateralt) og vil også kontrollere at et lignende nivå av differensiering er oppnådd. Et alternativ for 2D apikal infeksjon er mikroinjeksjon, som vil bruke en 3D organoid, men levere patogenet direkte inn i den apikale siden (se Bartfeld et al.27 for detaljer). Denne metoden krever en dyktig injektor for å sikre at patogenet er riktig plassert, og organoidene forblir intakte. Mikroinjeksjon brukes ofte i BSL-2-inneslutning og er kanskje ikke egnet for BSL-3-inneslutning.
En annen viktig vurdering når du utfører infeksjonsforsøk i 2D-frøorganoider er den endelige celletettheten. Som nevnt i trinn 2.3, vil 100-150 organoider bli sådd i en brønn av en 48-brønns plate eller en brønn av en 8-brønns glassbunnkammersklie. Avhengig av organoidlinjen og på personen som håndterer organoidene, kan størrelsen på disse organoidene være betydelig forskjellig. Dette kan resultere i svært forskjellige celletettheter i 48-brønnsplaten eller 8-brønns glassbunnkammersklie. Avhengig av enterisk virus, foretrekker noen virus mer sparsomme celler, mens andre også vil kunne infisere konfluente celler. Den molekylære opprinnelsen til slike forskjeller i infektivitet for forskjellige cellesamfluenser er ikke klart; Derfor bør pilotforsøk som tar sikte på å finne den beste celletettheten for det enteriske patogenet som er valgt, utføres før du utfører ytterligere nedstrøms karakterisering.
Ofte utføres FACS-sortering før du utfører encellet dråpeemulsjon. Dette trinnet brukes ofte til å skille død fra levende celler og enkeltceller fra dobler. Når du arbeider med BSL-3 patogener, krever det at anlegget er utstyrt med en passende FACS-sortering, noe som ikke ofte er tilfelle. Videre har ikke alle celler i en organoid samme størrelse, og det er ofte vanskelig å diskriminere mellom en dobbelt eller en større celle, og dermed forårsake risiko for negativ merking mot en bestemt celletype. Det er også fortsatt diskusjon i feltet om tiden det tar å sortere mellom 5.000-10.000 for hvert utvalg kan føre til en betydelig endring av transkripsjonsprofilen til de enkelte cellene. Mens cellefikseringsmetoder som er kompatible med encellet sekvensering (f.eks. metanol og RNAassist) er beskrevet, ble det observert at dette fører til en reduksjon i kvaliteten på sekvensering18. Til slutt mistenkes det at sortering av celler ved hjelp av celledødsmarkører også kan føre til en skjevhet. Gitt retningsmessig spredning og differensiering av cellene gjennom krypt-villi-aksen, er de mest differensierte cellene, som skal kastes og frigjøres, plassert på spissen av villi. Disse cellene er ofte positive for forskjellige markører av celledødsveier(f.eks. apoptose, nekrose og nekrose); Men når du ser på rotavirusinfeksjon i musens tarm, er spissen av villi det mest infiserte området28. Dermed vil filtrering av celler som kan se positive ut for dødsmarkører resultere i et negativt utvalg av de infiserte cellene som kan representere den fysiologiske infeksjonen. For tiden er det ingen god løsning for sortering og festing av organoider før encellet sekvensering. Bruk av levende, usorterte celler anbefales ettersom ytterligere studier er nødvendig for å finne passende alternative protokoller.
Sekvensering med én celle har revolusjonert hvordan cellulære svar kan evalueres. Denne teknikken gjør det mulig å identifisere cellelinjespesifikke responser både under basale forhold og under patogeninfeksjoner. Denne metoden har åpnet dører i mange felt som tidligere var begrenset av masseavlesninger. Selv om denne metoden er veldig kraftig, har den sine begrensninger. En viktig begrensning er den omfattende bioinformatiske analysen som kreves nedstrøms for sekvenseringen. Dette er spesielt viktig når du analyserer vev og tilordner celletyper der det for øyeblikket ikke er noen merknad. Å ha en dyktig bioinformatiker er nødvendig for å støtte alle encellede studier.
Denne protokollen beskriver hvordan man sår og håndterer humane tarmorganoider, smitter dem med enteriske patogener og utfører scRNAseq. Tilpasning av denne tilnærmingen til andre organer er nå mulig, da organoide modellsystemer er utviklet for de fleste organer. Lunge- og leverorganoider er tilsvarende organisert sammenlignet med intestinale organoider, og som sådan kan bruk av en analog tilnærming transponeres til disse organoidene. Den kritiske kontrollen vil være å validere at når de vokser i to dimensjoner eller sprakk åpne, oppnår disse organoidene lignende differensiering som deres 3D-organoide kolleger. De spesifikke egenskapene og genene som definerer en differensiert status, er spesifikke for hver organmodell. Andre organoidmodeller som nyre- og vaskulære organoider, store tette strukturer, vil trenge flere metoder for å seriell dissosiere disse strukturene i enkeltceller.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer og Steeve Boulant ble støttet av forskningsstipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Prosjektnummer 240245660, 278001972, 415089553 og 272983813 til Steeve Boulant og 416072091 til Megan Stanifer), delstaten Baden-Wuerttemberg og Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B til MS og 01KI20198A og (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) til SB. Skjemaer ble opprettet i BioRender.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |