Bruke endringer i bladoverføring for å undersøke kloroplastbevegelsen i Arabidopsis thaliana

Summary

Mange plantearter endrer plasseringen av kloroplaster for å optimalisere lysabsorpsjon. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker et enkelt, hjemmebygd instrument for å undersøke kloroplastbevegelsen i Arabidopsis thaliana-blader ved hjelp av endringer i overføring av lys gjennom et blad som proxy.

Abstract

Kloroplastbevegelse i blader har vist seg å bidra til å minimere fotoinhibition og øke veksten under visse forhold. Mye kan læres om kloroplastbevegelse ved å studere kloroplastposisjonering i blader ved hjelp av for eksempel konfettisk fluorescensmikroskopi, men tilgangen til denne typen mikroskopi er begrenset. Denne protokollen beskriver en metode som bruker endringene i bladoverføring som proxy for kloroplastbevegelse. Hvis kloroplaster spres ut for å maksimere lysavskjæring, vil overføringen være lav. Hvis kloroplaster beveger seg mot de anticlinale celleveggene for å unngå lys, vil overføringen være høyere. Denne protokollen beskriver hvordan du bruker et enkelt, hjemmebygd instrument for å eksponere blader for forskjellige blålysintensiteter og kvantifisere de dynamiske endringene i bladoverføring. Denne tilnærmingen gjør det mulig for forskere å kvantitativt beskrive kloroplastbevegelse i forskjellige arter og mutanter, studere effekten av kjemikalier og miljøfaktorer på den, eller skjerme for nye mutanter, for eksempel å identifisere manglende komponenter i prosessen som fører fra lysoppfattelse til bevegelse av kloroplaster.

Introduction

Lys er avgjørende for fotosyntese, plantevekst og utvikling. Det er en av de mest dynamiske abiotiske faktorene, da lysintensiteter ikke bare endres i løpet av en sesong eller dag, men også raskt og på uforutsigbare måter, avhengig av skydekket. På bladnivå påvirkes også lysintensiteter av tettheten og naturen til den omkringliggende vegetasjonen og plantens egen baldakin. En viktig mekanisme som gjør det mulig for planter å optimalisere lysavskjæring under variable lysforhold, er kloroplastenes evne til å bevege seg som svar på blålysstimuli1,2. Under dårlige lysforhold sprer kloroplaster seg vinkelrett på lyset (langs de periklinale celleveggene) i en såkalt akkumuleringsrespons, maksimerer lysavskjæring og dermed fotosyntese. Under høye lysforhold beveger kloroplaster seg mot den anticlinale celleveggen i en såkalt unngåelsesrespons, og minimerer lysavskjæring og faren for fotoinhibition. I mange arter antar kloroplaster også en bestemt mørk posisjon, som er forskjellig fra akkumulerings- og unngåelsesposisjonene og ofte mellomledd mellom de to ^tre,4. Ulike studier har vist at kloroplastbevegelse ikke bare er viktig for den kortsiktige stresstoleransen til ^blader5,6,7, men også for vekst og reproduktiv suksess for planter, spesielt under variable ^{lysforhold8,9}.

Kloroplastbevegelse observeres lett i sanntid i visse levende prøver (f.eks. alger eller tynnbladede planter som Elodea) ved hjelp av lysmikroskopi1. Å studere kloroplastbevegelse i de fleste blader krever imidlertid en forbehandling for å indusere kloroplastbevegelse, kjemisk fiksering og fremstilling av tverrsnitt før du ser på prøvene under et lysmikroskop10. Med introduksjonen av konfekt lasermikroskopi ble det også mulig å avbilde 3D-arrangementet av kloroplaster i intakte eller faste blader4,11,12. Disse avbildningsteknikkene bidrar i stor grad til forståelsen av kloroplastbevegelse ved å gi viktig kvalitativ informasjon. Kvantifisering av kloroplastposisjonering (f.eks. som en prosentandel kloroplaster i periclinale eller anticlinale posisjoner i disse bildene eller prosentandelen av areal dekket av kloroplaster per total celleoverflate) er også mulig, men ganske tidkrevende, spesielt hvis det utføres i intervallene som er nødvendige for å fange raske endringer i ^{posisjonering10,8} . Den enkleste måten å vise om mørktilpassede blader av en bestemt art eller mutanter er i stand til kloroplastbevegelse i unngåelsesresponsen, er ved å dekke det meste av området av et blad for å holde kloroplastene i mørket mens du utsetter en stripe av bladet for høyt lys. Etter minst 20 min med høy lyseksponering, vil kloroplastene i det eksponerte området ha beveget seg inn i unngåelsesposisjonen, og den eksponerte stripen vil være synlig lettere i fargen enn resten av bladet. Dette gjelder for vill type A. thaliana, men ikke for noen av kloroplastbevegelsens mutanter beskrevet mer detaljert senere ^på13. Denne metoden og modifikasjonene av den (f.eks. reversering av hvilke deler av bladet som er eksponert, skiftende lysintensiteter) er nyttige for å screene et stort antall mutanter og for å identifisere nullmutanter som mangler enten evnen til å utvise en unngåelse eller akkumuleringsrespons eller begge deler. Det gir imidlertid ikke informasjon om de dynamiske endringene i kloroplastbevegelsen.

I motsetning tillater metoden som er beskrevet her kvantifisering av kloroplastbevegelse i intakte blader ved hjelp av endringer i lysoverføring gjennom et blad som proxy for generell kloroplastbevegelse: Under forhold når kloroplaster spres ut i mesofyllcellene i akkumuleringsresponsen, overføres mindre lys gjennom bladet enn når mange kloroplaster er i en unngåelsesrespons, plassere seg langs de anticlinale celleveggene. Derfor kan endringer i overføring brukes som proxy for den generelle kloroplastbevegelsen i ^blader14. Instrumentets detaljer er beskrevet andre steder (se Tilleggsfil), men i utgangspunktet bruker instrumentet blått lys for å utløse kloroplastbevegelse og måler hvor mye rødt lys som overføres gjennom det bladet med innstilte intervaller. Mer nylig har en modifikasjon av dette systemet blitt beskrevet, som bruker en modifisert 96-brønns mikroplateleser, en blå LED, en datamaskin og en temperaturkontrollert ^inkubator15.

Muligheten til å bruke en kombinasjon av metoder, inkludert optisk vurdering av blader for screening, etterfulgt av måling av dynamiske endringer i overføring og bruk av mikroskopi, har i stor grad bidratt til vår forståelse av både de underliggende mekanismene og den fysiologiske/økologiske betydningen av kloroplastbevegelsen. For eksempel førte det til oppdagelsen og karakteriseringen av ulike mutanter, som er svekket i spesifikke aspekter av bevegelsene deres. For eksempel mangler A. thaliana phot 1 mutanter evnen til å akkumulere sine kloroplaster i lite lys, mens phot 2 mutanter mangler evnen til å utføre en unngåelsesreaksjon. Disse fenotypene skyldes en svekkelse i to respektive blålysreseptorer16,17,18. I motsetning mangler chup1 mutanter evnen til å danne riktige aktinfilamenter rundt kloroplastene som er avgjørende for å flytte kloroplastene til ønsket posisjon i en ^celle11,19. I tillegg til mutantstudier har forskere vurdert effekten av ulike hemmere på kloroplastbevegelse for å belyse de mekanistiske aspektene ved prosessen. For eksempel ble kjemikalier som _H2O2 og ulike antioksidanter brukt til å undersøke effekten av dette signalmolekylet på kloroplastbevegelse20. Ulike inhibitorer ble brukt til å belyse kalsiumets rolle i kloroplastbevegelsen21. I tillegg til å bidra til å avdekke mekanismene for kloroplastbevegelse, kan disse metodene brukes til å sammenligne kloroplastbevegelse i ulike arter eller mutanter dyrket under forskjellige forhold i et forsøk på å forstå den økologiske og evolusjonære konteksten av denne oppførselen. For eksempel har det vist seg at omfanget av effektene av ulike mutasjoner i kloroplastbevegelsesveien er avhengig av ^{vekstforholdene7,9}, og at soltilpassede planter ikke ser ut til å flytte kloroplastene mye. Derimot er bevegelse svært viktig for skyggeplanter10,22,23.

Dette metodepapiret, fokusert på modellanlegget A. thaliana, beskriver hvordan du bruker en overføringsenhet som er en oppdatert versjon av et tidligere utviklet ^instrument9. Selv om dette instrumentet ikke er kommersielt tilgjengelig, vil personer med grunnleggende forståelse av elektronikk eller hjelp av ingeniør- eller fysikkkolleger og studenter kunne bygge instrumentet ved hjelp av rimelige deler og følge de detaljerte instruksjonene (se Tilleggsfil). Åpen kildekode-plattformen som brukes til å bygge instrumentet har omfattende webstøtte og et fellesskapsforum som tilbyr hjelp hvis det skulle oppstå ^problemer24.

Protokollen fokuserer på hvordan du bruker instrumentet til å bestemme endringer i bladoverføring i et standard utforskende løp som utsetter et blad for et bredt spekter av lysforhold og fanger opp de mørke, akkumulerings- og unngåelsesreaksjonene til A. thaliana. Disse løypene kan endres avhengig av målet med eksperimentet og kan brukes med de fleste plantearter. Artikkelen gir eksempler på overføringsdata fra A. thaliana wildtype og flere mutanter og viser hvordan du analyserer dataene ytterligere.

Protocol

1. Forbereder blader for en løpetur Plasser 8 A. thaliana planter i mørket over natten (> 6 h fungerer for de fleste arter) for å sikre at kloroplastene beveger seg i sin mørke posisjon. Alle replikaer starter med sammenlignbare overføringsverdier. Alternativt kan du plassere 8 komplette blader i en Petri-tallerken med et fuktig filterpapir nederst, lukke Petri-parabolen og pakke den med aluminiumsfolie. 2. Teste om overføringsenheten fungerer <li…

Representative Results

De ulike delene av overføringsenheten er vist i figur 1. Mikrokontrolleren er enhetens kontrollenhet og styrer lysforholdene som bladene, sikret i svarte bladklips, opplever, og lagrer lysoverføringsdataene den mottar (figur 1A, B). Et nærbilde av instrumentets kontrollenhet viser PÅ/AV-knappen, SD-kortet for datalagringskapasitet, Bluetooth-skjoldet (som sender dataene til LeafSensor-appen ) og kablene som kobles til lysdiodene (ly…

Discussion

Enheten er ekstremt enkel å bruke, men det er av avgjørende betydning å kalibrere hvert bladklemmeoppsett av overføringsenheten uavhengig av hverandre, siden plasseringen av lysdiodene og fototransistorene kan variere noe fra bladklemme til bladklips. Sørg for at lysdiodene og fototransistorene settes inn stabilt og kontroller kalibreringen på nytt hvis dataene virker av. Unngå å få vann på apparatet. Bladene i bladklemmene er plassert i “båter” fylt med vann for å unngå vannstress. Plasser disse båtene, fo…

Materials

Aluminum foil
Dark adapted leaves
Filter paper
iPad with LeafSensor app installed (see Supplemental Info)
Pipette	Any
Petri dish	Any
Transmission device (see Supplemental info)
Water