Isolering og udvælgelse af entomopatogene svampe fra jordprøver og evaluering af svampe virulens mod skadedyr
Summary
Her præsenterer vi en protokol baseret på melorme (Tenebrio molitor)-agn system, der blev brugt til at isolere og vælge entomopathogene svampe (EPF) fra jordprøver. En effektiv conidia nummer (ECN) formel bruges til at vælge høj stresstolerant EPF baseret på fysiologiske egenskaber for skadedyr mikrobiel kontrol i marken.
Abstract
Entomopatogene svampe (EPF) er et af de mikrobielle kontrolmidler til integreret skadedyrsbekæmpelse. For at kontrollere lokale eller invasive skadedyr er det vigtigt at isolere og vælge indfødte EPF. Derfor blev jord agnmetoden kombineret med insekt agn (melorme, Tenebrio molitor) system brugt i denne undersøgelse med nogle ændringer. Den isolerede EPF blev derefter underkastet virulenstesten mod landbrugs skadedyret Spodoptera litura. Desuden blev de potentielle EPF-stammer udsat for morfologiske og molekylære identifikationer. Desuden blev conidia-produktionen og termotoleranceanalysen udført for de lovende EPF-stammer og sammenlignet; disse data blev yderligere erstattet af formlen for effektivt conidianummer (ECN) for laboratorierangering. Jord agn-melorme system og ECN formel kan forbedres ved at erstatte insektarter og integrere flere stressfaktorer til evaluering af kommercialisering og anvendelse af marken. Denne protokol giver en hurtig og effektiv tilgang til EPF-udvælgelse og vil forbedre forskningen i biologiske kontrolmidler.
Introduction
I øjeblikket er entomopatogene svampe (EPF) meget udbredt i den mikrobielle kontrol af landbrugs-, skov- og gartneri skadedyr. Fordelene ved EPF er dens brede udvalg, god miljømæssig tilpasningsevne, miljøvenlig natur, og at den kan bruges sammen med andre kemikalier for at vise den synergistiske effekt for integreret skadedyrsbekæmpelse1,2. Til påføring som skadedyrsbekæmpelsesmiddel er det nødvendigt at isolere et stort antal EPF fra enten syge insekter eller det naturlige miljø.
Prøveudtagningen af disse organismer fra deres værter hjælper med at forstå den geografiske fordeling og prævalens af EPF i naturlige værter3,4,5. Imidlertid er samlingen af svampeinficerede insekter normalt begrænset af miljømæssige faktorer og insektpopulationer i marken4. I betragtning af at insekt værter vil dø efter EPF-infektion og derefter falde i jorden, isolering af EPF fra jordprøver kan være en stabil ressource3,6. For eksempel er saprofitter kendt for at bruge den døde vært som deres ressource til vækst. Jord agn og selektive medium systemer er blevet meget brugt til at opdage og isolere EPF fra jorden3,4,7,8,9,10.
I den selektive mediummetode er den fortyndede jordopløsning belagt på et medium, der indeholder bredspektrede antibiotika (f.eks. chloramphenicol, tetracyklin eller streptomycin) for at hæmme væksten af bakterier2,3,9,11. Det er dog blevet rapporteret, at denne metode kan fordreje stammens mangfoldighed og tæthed og kan forårsage en over- eller undervurdering af mange mikrobielle samfund6. Desuden er de isolerede stammer mindre patogene og konkurrerer med saprofytter under isolation. Det er vanskeligt at isolere EPF fra den fortyndede jordopløsning3. I stedet for at bruge et selektivt medium isolerer jord agnmetoden EPF fra de inficerede døde insekter, som kan opbevares i 2-3 uger, hvilket giver en mere effektiv og standard EPF-adskillelsesmetode3,4,7,6. Fordi metoden er let at betjene, kan man isolere en række patogene stammer til en lav pris4. Derfor er det meget udbredt af mange forskere.
Ved sammenligning af de forskellige typer af insekt agn systemer, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae er de mest almindelige EPF arter, der findes i insekter, der tilhører Hemiptera, Lepidoptera, Blattella, og Coleoptera6,12,13,14. Blandt disse insekt lokkemad, Galleria mellonella (bestil Lepidoptera) og Tenebrio molitor (ordre Coleoptera) viser højere inddrivelse satser beauveria og Metarhizium spp., sammenlignet med andre insekter. Derfor er G. mellonella og T. molitor almindeligt anvendt til insekt baiting. I årenes løb har United States Department of Agriculture (USDA) etableret et EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), der indeholder en bred vifte af arter, herunder 4081 arter af Beauveria spp., 18 arter af Clonostachys spp., 878 arter af Cordyceps spp., 2473 arter af Metarhizium spp., 226 arter af Purpureocillium spp., og 13 arter af Pochonia spp. blandt andre15. Et andet EPF-bibliotek blev bygget af Entomology Research Laboratory (ERL) fra University of Vermont i USA i ca. 30 år. Det omfatter 1345 stammer af EPF fra USA, Europa, Asien, Afrika og Mellemøsten16.
For at kontrollere lokale eller invasion skadedyr i Taiwan, isolation og udvælgelse af indfødte EPF er påkrævet. Derfor har vi i denne protokol ændret og beskrevet proceduren for jordens agnmetode og kombineret den med insekt agn (melorme, Tenebrio molitor) system17. På grundlag af denne protokol blev der oprettet et EPF-bibliotek. Der blev udført to screeningsrunder (kvantificering af podning) for de foreløbige EPF-isolater. EPF-isolater viste sygdomsfremkaldende for insekter. De potentielle stammer blev udsat for morfologiske og molekylære identifikationer og yderligere analyseret af termotolerance og konidial produktion assay. Desuden blev der også foreslået et begreb om et effektivt conidianummer (ECN). Ved hjælp af ECN-formel og hovedkomponentanalyse (PCA) blev de potentielle stammer analyseret under simuleret miljøtryk for at fuldføre processen med at etablere og screene EPF-biblioteket. Efterfølgende blev patogenitet af lovende EPF-stammer testet for mål skadedyr (f.eks Spodoptera litura). Den nuværende protokol integrerer termotolerance- og konidiale produktionsdata i ECN-formlen og PCA-analysen, som kan bruges som standardrangeringssystem for EPF-relateret forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entomopatogene svampe (EPF) er blevet anvendt til insektbekæmpelse. Der er flere metoder til at isolere, vælge og identificere EPF30,31,32. Ved at sammenligne de forskellige typer insekt agn metoder, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae var almindeligt forekommende i insekt lokkemad6,12,13,14.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
