Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi
Summary
Qui presentiamo un protocollo basato sul sistema di esca del verme della farina (Tenebrio molitor) che è stato utilizzato per isolare e selezionare funghi entomopatogeni (EPF) da campioni di suolo. Una formula efficace del numero di conidi (ECN) viene utilizzata per selezionare EPF ad alta tolleranza allo stress in base alle caratteristiche fisiologiche per il controllo microbico dei parassiti sul campo.
Abstract
I funghi entomopatogeni (EPF) sono uno degli agenti di controllo microbico per la gestione integrata dei parassiti. Per controllare i parassiti locali o invasivi, è importante isolare e selezionare l’EPF indigeno. Pertanto, il metodo dell’esca del suolo combinato con il sistema di esca per insetti (verme della farina, Tenebrio molitor) è stato utilizzato in questo studio con alcune modifiche. L’EPF isolato è stato quindi sottoposto al test di virulenza contro il parassita agricolo Spodoptera litura. Inoltre, i potenziali ceppi di EPF sono stati sottoposti a identificazioni morfologiche e molecolari. Inoltre, sono stati eseguiti i test di produzione e termotolleranza dei conidi per i promettenti ceppi di EPF e confrontati; questi dati sono stati ulteriormente sostituiti nella formula del numero di conidi effettivi (ECN) per la classificazione di laboratorio. Il sistema esche-vermi della farina del suolo e la formula ECN possono essere migliorati sostituendo le specie di insetti e integrando più fattori di stress per la valutazione della commercializzazione e dell’applicazione sul campo. Questo protocollo fornisce un approccio rapido ed efficiente per la selezione dell’EPF e migliorerà la ricerca sugli agenti di controllo biologico.
Introduction
Attualmente, i funghi entomopatogeni (EPF) sono ampiamente utilizzati nel controllo microbico di parassiti agricoli, forestali e orticoli. I vantaggi dell’EPF sono le sue ampie gamme di ospiti, la buona adattabilità ambientale, la natura ecocompatibile e il fatto che possa essere utilizzato con altre sostanze chimiche per mostrare l’effetto sinergico per la gestione integrata dei parassiti1,2. Per l’applicazione come agente di controllo dei parassiti, è necessario isolare un gran numero di EPF da insetti malati o dall’ambiente naturale.
Il campionamento di questi organismi dai loro ospiti aiuta a comprendere la distribuzione geografica e il tasso di prevalenza dell’EPF negli ospiti naturali3,4,5. Tuttavia, la raccolta di insetti infetti da funghi è solitamente limitata da fattori ambientali e popolazioni di insetti nel campo4. Considerando che gli ospiti degli insetti moriranno dopo l’infezione da EPF e poi cadranno nel terreno, l’isolamento dell’EPF dai campioni di suolo potrebbe essere una risorsa stabile3,6. Ad esempio, i saprofiti sono noti per utilizzare l’ospite morto come risorsa per la crescita. L’esca del suolo e i sistemi di mezzo selettivo sono stati ampiamente utilizzati per rilevare e isolare l’EPF dal suolo3,4,7,8,9,10.
Nel metodo del mezzo selettivo, la soluzione di terreno diluito viene placcata su un mezzo contenente antibiotici ad ampio spettro (ad esempio, cloramfenicolo, tetraciclina o streptomicina) per inibire la crescita dei batteri2,3,9,11. Tuttavia, è stato riportato che questo metodo può distorcere la diversità e la densità del ceppo e può causare una sovrastima o sottostima di molte comunità microbiche6. Inoltre, i ceppi isolati sono meno patogeni e competono con i saprofiti durante l’isolamento. È difficile isolare l’EPF dalla soluzione di terreno diluito3. Invece di utilizzare un mezzo selettivo, il metodo dell’esca del suolo isola l’EPF dagli insetti morti infetti, che possono essere conservati per 2-3 settimane, fornendo così un metodo di separazione EPF più efficiente e standard3,4,7,6. Poiché il metodo è facile da usare, è possibile isolare una varietà di ceppi patogeni a basso costo4. Pertanto, è ampiamente utilizzato da molti ricercatori.
Confrontando i diversi tipi di sistemi di esche per insetti, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae sono le specie di EPF più comuni che si trovano negli insetti appartenenti agli Hemiptera, Lepidoptera, Blattella e Coleoptera6,12,13,14. Tra queste esche per insetti, Galleria mellonella (ordine Lepidoptera) e Tenebrio molitor (ordine Coleoptera) mostrano tassi di recupero più elevati di Beauveria e Metarhizium spp., rispetto ad altri insetti. Pertanto, G. mellonella e T. molitor sono comunemente usati per l’esca degli insetti. Nel corso degli anni, il Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) ha istituito una biblioteca EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) che contiene un’ampia varietà di specie, tra cui 4081 specie di Beauveria spp., 18 specie di Clonostachys spp., 878 specie di Cordyceps spp., 2473 specie di Metarhizium spp., 226 specie di Purpureocillium spp., e 13 specie di Pochonia spp. tra gli altri15. Un’altra biblioteca EPF è stata costruita dall’Entomology Research Laboratory (ERL) dell’Università del Vermont negli Stati Uniti per circa 30 anni. Comprende 1345 ceppi di EPF provenienti da Stati Uniti, Europa, Asia, Africa e Medio Oriente16.
Per controllare i parassiti locali o di invasione a Taiwan, è necessario l’isolamento e la selezione dell’EPF indigeno. Pertanto, in questo protocollo, abbiamo modificato e descritto la procedura del metodo dell’esca del suolo e l’abbiamo combinata con il sistema di esca per insetti (verme della farina, Tenebrio molitor)17. Sulla base di questo protocollo, è stata istituita una libreria EPF. Sono stati eseguiti due cicli di screening (quantificazione dell’inoculazione) per gli isolati preliminari di EPF. Gli isolati di EPF hanno mostrato patogenicità agli insetti. I ceppi potenziali sono stati sottoposti a identificazioni morfologiche e molecolari e ulteriormente analizzati mediante il test di termotolleranza e produzione conidiale. Inoltre, è stato proposto anche un concetto di numero di conidi effettivi (ECN). Utilizzando la formula ECN e l’analisi dei componenti principali (PCA), i ceppi potenziali sono stati analizzati sotto pressione ambientale simulata per completare il processo di creazione e screening della libreria EPF. Successivamente, la patogenicità di ceppi di EPF promettenti è stata testata per il parassita bersaglio (ad esempio, Spodoptera litura). L’attuale protocollo integra i dati di termotoleranza e produzione conidiale nella formula ECN e nell’analisi PCA, che può essere utilizzata come sistema di classificazione standard per la ricerca relativa all’EPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
I funghi entomopatogeni (EPF) sono stati utilizzati per il controllo degli insetti. Esistono diversi metodi per isolare, selezionare e identificare EPF30,31,32. Confrontando i diversi tipi di metodi di esca per insetti, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae sono stati comunemente trovati nelle esche per insetti6,12,13,14.<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata da Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
