토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가
Summary
여기서 우리는 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류 (EPF)를 분리하고 선택하는 데 사용 된 식사 벌레 (Tenebrio molitor)-미끼 시스템을 기반으로 프로토콜을 제시합니다. 효과적인 코니디아 번호(ECN) 포뮬러는 현장에서 해충 미생물 조절을 위한 생리적 특성에 기초하여 높은 스트레스 내성 EPF를 선택하는 데 사용된다.
Abstract
내토모병원성 균류(EPF)는 통합 해충 관리를 위한 미생물 방제제 중 하나입니다. 지역 해충 또는 침습 해충을 제어하려면 토착 EPF를 분리하고 선택하는 것이 중요합니다. 따라서, 곤충 미끼(mealworm, Tenebrio molitor) 시스템과 결합된 토양 미끼 방법은 일부 수정과 함께 본 연구에서 사용되었다. 고립된 EPF는 농업 해충 스포드옵테라 리투라에 대한 독성 검사를 받았다. 더욱이, 잠재적인 EPF 균주는 형태학적 및 분자 식별을 실시하였다. 또한, 코니아 생성 및 열온성 분석은 유망한 EPF 균주에 대해 수행되었고 비교; 이러한 데이터는 실험실 순위를 위한 효과적인 코니디아 번호(ECN)의 공식으로 더 대체되었다. 토양 미끼-식사 웜 시스템과 ECN 포뮬러는 곤충 종을 대체하고 상용화 및 현장 응용 평가를 위해 더 많은 스트레스 요인을 통합하여 개선할 수 있습니다. 이 프로토콜은 EPF 선택에 대한 빠르고 효율적인 접근 방식을 제공하고 생물학적 제어 제에 대한 연구를 향상시킬 것입니다.
Introduction
현재, 내토모병원성 균류(EPF)는 농업, 숲 및 원예 해충의 미생물 대조에 널리 사용되고 있다. EPF의 장점은 넓은 숙주 범위, 좋은 환경 적응성, 환경 친화적 인 특성이며, 통합 해충 관리를위한 시너지 효과를 보여주기 위해 다른 화학 물질과 함께 사용할 수 있다는 것입니다1,2. 해충 방제제로서 의신청의 경우, 병든 곤충이나 자연 환경으로부터 많은 수의 EPF를 분리할 필요가 있다.
그들의 호스트에서 이 유기체의 견본은 자연 호스트에 있는 EPF의 지리적 분포 그리고 보급 비율을 이해하는 데 도움이 3,4,5. 그러나, 곰팡이 감염 곤충의 수집은 일반적으로 분야에서 환경 요인과 곤충 인구에 의해 제한됩니다4. 곤충 호스트가 EPF 감염 후 죽고 토양에 빠질 것이라는 점을 고려할 때 토양 샘플에서 EPF를 분리하는 것은 안정적인 자원이 될 수 있습니다3,6. 예를 들어, 사프로피테는 죽은 호스트를 성장을 위한 자원으로 사용하는 것으로 알려져 있습니다. 토양 미끼 및 선택적 중간 시스템은 토양으로부터 EPF를 검출하고 분리하는 데 널리 사용되어 왔다3,4,7,8,9,10.
선택적 중간 방법에서, 희석된 토양 용액은 박테리아의 성장을 저해하기 위해 광범위한 항생제(예를 들어, 클로람페니콜, 테트라사이클린 또는 연쇄상 구균신)를 포함하는 매체에 도금된다2,3,9,11. 그러나, 이 방법은 긴장의 다양성과 밀도를 왜곡할 수 있고 많은 미생물 지역 사회의 과소 또는 과소 추정을 일으키는 원인이 될 수 있다는 것을 보고되었습니다6. 더욱이, 고립된 긴장은 더 적은 병원성이고 격리 도중 saprophytes와 경쟁합니다. 희석된 토양 용액으로부터 EPF를 분리하기 어렵다3. 선별적 배지를 사용하는 대신, 토양 미끼 방법은 감염된 죽은 곤충으로부터 EPF를 분리하여 2-3주 동안 보관할 수 있어 보다 효율적이고 표준적인 EPF 분리 방법을 제공한다3,4,7,6. 이 방법은 조작이 용이하기 때문에, 저렴한 비용으로 다양한 병원성 균주를 분리할 수 있다. 따라서 많은 연구자들이 널리 사용합니다.
곤충 미끼 시스템의 다른 유형을 비교하면, 보베리아 bassiana와 Metarhizium 애니소플리아는 헤미트라, 레피도페라, 블라텔라 및 콜옵테라6,12,13,14에 속하는 곤충에서 발견되는 가장 일반적인 EPF 종입니다. 이 곤충 미끼 중, 갤러리아 멜로넬라 (순서 레피도페라) 테네리오 몰리터 (주문 콜로페라) 보베리아와 Metarhizium spp의 높은 복구 비율을 보여줍니다., 다른 곤충에 비해. 따라서 G. 멜론넬라와 T. 몰리터는 곤충 미끼에 일반적으로 사용됩니다. 수년에 걸쳐, 미국 농무부(USDA)는 4081종의 보베리아 스PP, 18종의 클로노스타치스 스PP, 878종의 동충하하초 스PP, 2473종의 메흐라이즈 퍼실(Metarhizpurium)을 포함한 다양한 종을 포함하는 EPF 도서관(EPF 문화, ARSEF의 농업 연구 서비스 컬렉션)을 설립했습니다. 그리고 13 종의 포코니아 spp. 또 다른 EPF 도서관은 미국 버몬트 대학교에서 30년 동안 곤충학 연구소(ERL)에 의해 지어졌습니다. 여기에는 미국, 유럽, 아시아, 아프리카 및 중동 116의 EPF 균주 1345개균이 포함됩니다.
대만의 지역 또는 침공 해충을 통제하려면 원주민 EPF의 고립과 선택이 필요합니다. 따라서, 본 프로토콜에서, 우리는 토양 미끼 방법의 절차를 수정하고 설명하고 곤충 미끼 (식사 벌레, 테네리오 몰리토르) 시스템과 결합17. 이 프로토콜에 따라 EPF 라이브러리가 설정되었습니다. 예비 EPF 분리를 위해 2회 선별(접종의 정량화)이 수행되었다. EPF 분리는 곤충에 대한 병원성을 보였다. 잠재적인 균주는 형태학적 및 분자 식별을 실시하고 열성 편협및 편정 생산 분석에 의해 추가 분석되었다. 또한 효과적인 코니디아 번호(ECN)의 개념도 제안되었다. ECN 공식 및 주 성분 분석(PCA)을 사용하여, 잠재적인 균주는 EPF 라이브러리를 설치하고 선별하는 과정을 완료하기 위해 시뮬레이션된 환경 압력하에서 분석되었습니다. 그 후, 유망한 EPF 균주의 병원성은 표적 해충(예를 들어, 스포드옵테라 리투라)에 대해 시험하였다. 현재 프로토콜은 ECN 포뮬러 및 PCA 분석에 열편도 및 원전 생산 데이터를 통합하여 EPF 관련 연구를 위한 표준 순위 시스템으로 사용할 수 있습니다.
Protocol
참고: 전체 순서도는 그림 1에 표시됩니다. 1. 잠재적인 내토모병원성 균류(EPF)의 격리 및 선택 토양 샘플 수집 표면 토양의 1cm를 제거한 다음 각 샘플링 부위의 삽을 사용하여 5-10cm 깊이 내에 있는 토양을 수집합니다.참고: 샘플링 사이트는 인위적으로 분사된 EPF 균주의 오염을 피하기 위해 산, 숲 또는 인구밀도가 낮은 지역이 될 것입니?…
Representative Results
격리 및 선택 잠재적 인 엔토모병원성 균류 (EPF)테네리오 몰리토르 매개 엔토모병원성 균류(EPF) 라이브러리 시공 방법을 사용하여 곤충 살상 활동이 없는 곰팡이의 수는 제외될 것이다. 따라서, EPF의 격리 효율과 선택은 크게 증가 될 수있다. 이 방법의 적용 동안 샘플링 부위, 토양 샘플 및 곰팡이 발아 율의 정보가 기록되었습니다(표 2)…
Discussion
곤충병원성 균류(EPF)는 곤충 조절에 사용되어 왔다. EPF30,31,32를 분리, 선택 및 식별하는 몇 가지 방법이 있습니다. 곤충 미끼 방법의 다른 종류를 비교, 보베리아 bassiana와 Metarhizium 애니소플리아 곤충 미끼에서 일반적으로 발견 되었다6,12,13,14.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 그랜트에 의해 지원되었다 109-2313-B-005 -048 -MY3 과학기술부에서 (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
References
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Cite This Article
Liu, Y., Ni, N., Chang, J., Li, Y., Lee, M. R., Kim, J. S., Nai, Y. Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests. J. Vis. Exp. (175), e62882, doi:10.3791/62882 (2021).