형광-활성화된 세포 분류-방사성리간드 처리된 조직(FACS-RTT)은 알츠하이머병에서 세포 규모로 18kDa 트랜스로케이터 단백질 또는 세로토닌 5HT2A-수용체 발현의 역할을 연구하는 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 TgF344-AD 래트 모델에서 FACS-RTT의 생체외 적용을 기술한다.
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방법 논문
형광-활성화된 세포 분류-방사성 신호의 세포 기원을 결정하기 위한 방사성리간드 처리조직(FACS-RTT)
이 논문에서
요약
초록
신경교세포는 아마도 알츠하이머병(AD)과 같은 신경퇴행성 장애의 병태생리학에 상당한 영향을 미칠 것이다. 그들의 변화는 아마도 전염증성 상태와 관련이 있습니다. TgF344-AD 래트 균주는 아밀로이드 단백질 Aβ-40 및 Aβ-42를 코딩하는 인간 APP와 인간 PS1ΔE9 유전자를 발현하도록 설계되었으며 노화와 함께 아밀로이드 병리학 및 인지 결핍을 나타낸다. TgF344-AD 래트 모델은 AD에서 교란될 가능성이 있는 18 kDa 트랜스로케이터 단백질 (TSPO, 신경교세포 활성화의 마커) 결합 및 5HT 2A 수용체 (5HT2AR) 세로토닌 수용체 수준의 세포 기원을 평가하기 위해 본 연구에 사용된다. 여기에 제시된 기술은 방사성 리간드 처리 조직에 대한 형광 활성화 세포 분류 (FACS-RTT), 생체 내 PET 또는 SPECT 또는 생체 외 / 시험관 내 자가방사선 촬영 기술과 보완적인 정량적 세포 유형 특이적 기술입니다. 그것은 세포 측정 세포 분류 후 γ 카운터를 사용하여 이미징에 이전에 사용 된 것과 동일한 방사성 표지 추적기를 정량화합니다. 이것은 높은 세포 특이성 및 민감도를 갖는 방사성 표지된 단백질의 세포 기원을 결정할 수 있게 한다. 예를 들어, FACS-RTT를 사용한 연구는 (i) TSPO 결합의 증가가 리포폴리사카라이드(LPS)-유도된 신경염증의 래트 모델에서 미세아교세포와 연관되었고, (ii) 12개월 및 18개월에서의 TSPO 결합의 증가는 성상세포와 먼저 연관되었고, 이어서 야생형(WT) 래트와 비교하여 TgF344-AD 래트에서의 미세아교세포, 및 (iii)5HT2A의 삼중항 밀도와 관련이 있다는 것을 보여주었다. R은 동일한 래트 AD 모델에서 18개월에 성상세포에서 감소한다. 흥미롭게도,이 기술은 거의 모든 방사선 추적기로 확장 될 수 있습니다.
서론
알츠하이머 병 (AD)과 같은 신경 퇴행성 질환은 증상 증가와 관련된 신경 세포 손실을 특징으로합니다. 치매의 가장 흔한 원인 인 AD는 사례의 60 % -70 %를 차지하며 전 세계 약 5 천만 명의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 신경 병리학 적 수준에서 AD의 두 가지 주요 특징은 세포 외 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 세포 내 타우 신경 세동 엉킴의 축적입니다. 신경교 세포 변화는 또한 AD2 및 여러 신경 전달 물질 시스템 3,4의 가능한 파괴와 관련이 있습니다.
TgF344-AD 래트 라인은 인간 APP 및 PS1ΔE9 전이유전자를 발현함으로써 AD를 모델로 변형시켜 가용성 및 불용성 Aβ-40 및 Aβ-42 발현 및 아밀로이드 플라크 형성5를 유도하였다. 또한 타우병증으로 이어지는 타우 단백질의 과인산화 형태의 축적을 제시한다. 9-24 개월의 나이부터, 쥐는 점차적으로 AD의 병리학 적 특징과인지 장애 5,6,7,8....
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프로토콜
모든 실험 절차는 제네바 광저우의 인간 및 동물 실험 윤리위원회, 연구 윤리를위한 광저우위원회 (CCER) 및 제네바 광저우 건강 (스위스)의 일반 방향과 각각 합의하여 수행되었습니다. 데이터는 동물 연구: 생체 내 실험(ARRIVE) 지침 보고에 따라 보고됩니다.
1. SPECT 카메라 준비 및 보정
- 카메라를 켜고 운영 소프트웨어를 로드 합니다(자료 표 참조). 홈 XYZ 스테이지 버튼을 클릭하여 호밍을 수행합니다.
- 하나의 10분 스캔 획득으로 구성된 실험을 설정합니다. 스 텝 모드를 Fine 으로 설정하고 획득 모드를 Listmode 로 설정합니다(전체 방출 스펙트럼을 기록하기 위해).
- 침대를 설치하고 온난화 시스템, 호흡 센서 및 마취가 기능적이고 안전한지 확인하십시오 (그림 1A-D). 이어서, 동물의 머리가 위치될 팬텀(즉, 2 mL 마이크로퍼지 튜브에 알려진 농도의 125I의 2 m....
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결과
WT 래트는 일방적 LPS 주사 후 [125I]CLINDE 방사성추적기를 사용한 생체내 SPECT 스캔을 경험하였다(도 2). 이 스캔 (방사선 추적기 주사 후 45-60 분의 이미지로부터의 합산 데이터 사용)은 뇌의 대측성 영역에서보다 LPS 주사 부위 (도 2A)에서 [125I]CLINDE의 더 높은 결합을 보였다 (도 2B). FACS-RTT를 시행한 생체외 샘플은 이러한 결과를 확인하고 미세아교세포에서만 더 많은 수의 [125I]CLINDE 결합 부위의 존재를 밝혀냈으며, 이는 뇌의 동측성 측에서 [125I]CLINDE 신호의 세포 기원이 미세아교세포였음을 보여준다(도 3A)15.
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토론
우리의 지식에 따르면,이 기술은 세포 수준에서 방사성 추적기의 생체 내 결합 변경에 대한 더 나은 이해를 가능하게하는 접근법을 설명하는 최초의 기술이었습니다. 이 프로토콜은 예로서 [125 I]CLINDE (TSPO) 또는 [125I]R91150 (5HT2AR)을 사용하여 세포 수준에서 방사성 추적자 결합을 정량화하는 다중스케일 방법을 기술한다.
이 기술은 LPS에 의해 유도되는 강렬한 염증 반응에서부터 AD의 래트 모델에서 관찰된 보다 미묘한 신경교세포 변화에 이르기까지 광범위한 신경교세포 변화의 세포 기원을 정밀하게 검출할 수 있을 정도로 견고하고 민감하며, SPECT로 얻은 신호의 미세아교세포 기원으로서 생체내 핵 신경영상에 중요한 상보적 정보를 가져온다. 이 연구는 FACS-RTT가5HT2AR의 예와 함께 세포 규모에서 신경 수용체 밀도 변화를 식별 할 수 있음을.......
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공개 사항
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (보조금 번호 320030-184713)의 지원을 받았다. 저자 BBT와 KC는 Velux Foundation (프로젝트 n. 1123)의 지원을 받습니다. 저자 ST는 스위스 국립 과학 재단 (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus 장학금) 교수, Jean and Madeleine Vachoux Foundation.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세트산 | 시그마 Aldrich | ||
| 아세토니트릴 | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | 바이탈 체크를 위한 | BioVet | |
| Bondclone C18 역상 칼럼 | Phenomenex, Schlieren, 스위스 | ||
| 네바 | 데스-쉬르 | Virucide | |
| Fc 블록/안티-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | 쥐에 대한 반응 |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | 쥐에 대한 반응 |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G 카테터 |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | 비즈와 미엘린 제거 완충액이 함유되어 있습니다. |
| NaCl 0.9% 멸균 용액 | B. Braun | 395202 | |
| 신경 해리 키트 (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | 효소 혼합물, 피펫 1, 2 및 3을 포함합니다. |
| 나일론 메쉬 시트 | Amazon | CMN-0074-10YD | 40인치 너비, 80미크론 크기 메쉬 |
| 과아세트산 | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 pré cursor | CERMN | ||
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| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| 트리부틸린 전구체 | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | 버전 Rec2.38c | SPECT 이미지 재구성용 소프트웨어 |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | 감마 카운터 |
참고문헌
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al.
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