シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法
Summary
シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。
Abstract
シロイヌナズナは、機能研究に最も広く使用されている植物モデル種です。シロイヌナズナの種子の表面滅菌は、この目的に向かって必要とされる基本的なステップです。したがって、数十~数百個のサンプル(トランスジェニックライン、エコタイプ、または変異体)を一度に処理するハイスループットシロイヌナズナシス種子表面滅菌法を確立することが最も重要です。一般的な真空ポンプから構築された自家製の吸引装置を用いたチューブ内の液体の効率的な除去に基づく種子表面滅菌法を本研究で紹介する。この方法で、1日に数百個のサンプルを処理することで、労働集約的なハンズオン時間を劇的に短縮することで、少しの労力で可能になります。シリーズタイムコース分析は、高い発芽率を維持することにより、表面滅菌の非常に柔軟な時間範囲をさらに示しました。この方法は、種子サイズに応じて吸引装置の簡単なカスタマイズ、および液体を排除するために望まれる速度で、他の種類の小さな種子の表面滅菌に容易に適応することができる。
Introduction
シロイヌナズナは、ブラッシカ科に属する二分植物種です。その比較的短いライフサイクル(長い日の成長条件下で一世代あたり2ヶ月)、小さな植物のサイズ、および植物ごとに何百もの種子の生産と自己受粉は、それを最初の基本的な植物モデル種1、2にしました。さらに、そのゲノムは完全に配列3であり、広範な逆遺伝学ツール(飽和T-DNA、トランスポゾン、および化学的変異体化された集団)が利用可能である4、5、6、および効果的なアグロバクテリウム媒介変換は、さらに下流作業のための十分なトランスジェニックラインを得るために十分確立されている7 .したがって、過去20年間に、自然、遺伝的、表現型のバリエーション8、9を含む分子レベルで植物生物学の多様な側面を解剖するためのモデル種としてシロイヌナズナシスを使用して大きな進歩が達成されました。
シロイヌナズナの目的の遺伝子を機能的に特徴付けるためには、種子表面滅菌は、無菌培養を必要とする多くの下流プロトコルの前提条件となる真菌および細菌汚染物質を排除する。過剰発現10に対する遺伝的形質転換は、ノックダウン(RNA-I11)またはノックアウト(ゲノム編集12、13)の遺伝子機能、細胞内局在化14、プロモーター活性15、16、タンパク質タンパク質17およびタンパク質-DNA相互作用18の、最も一般的な用途のみを引用し、すべて種子表面滅菌工程を必要とする。したがって、その相対的な単純さにもかかわらず、種子表面滅菌は、多くの機能解析において基本的な役割を果たす。
これまで、2つの主要なカテゴリーの種子表面滅菌方法が、気相滅菌法または液相滅菌法19に基づいて開発されてきた。ガス相シード表面滅菌のスループットは中~高であるが、有害試薬塩素ガスを表面殺菌剤として用いることは、その広い用途を妨げている。逆に液相殺菌に基づく方法は、表面殺菌のためにエタノールや漂白剤溶液のような穏やかな化学物質に依存しており、塩素燻蒸よりも本質的に低い効率を有するにもかかわらず、より広く使用されています。一般に、液体試薬を用いる2つの異なる方法が一般的に使用されている。1つの主に使用される方法は、時間20、21の異なる期間の異なる濃度でエタノールと漂白剤で洗浄に基づいている。別の方法は、漂白剤のみの21、22の適用に基づいています。どちらの方法も主に小規模な種子表面滅菌に適用されます。しかしながら、多くの実験において、1つの変換15、23、または画面から得られる多くのシロイヌナズナのトランスジェニックラインを、異なる変換24,25から生成される多くのトランスジェニックラインを並行してスクリーニングする必要がある。我々の知る限りでは、高スループット種子表面滅菌のための液体ベースの方法は公開されておらず、これはほとんど認識されていないが、機能的ゲノミクスのアプローチのための重要なボトルネックである。したがって、種子表面滅菌のための安全で堅牢で高スループットな方法を開発することは、一度に多くの遺伝子の機能的特性評価の成功に向けて必要かつ重要なステップです。
この目的のために、現在の研究では、シロイヌナズナの種子の表面滅菌のための改善された方法が提示される。この方法は安全で、低コストで、非常に堅牢で、高スループットで、種表面滅菌の初めからペトリ皿の種子播種の終わりまで1時間以内に96本の独立したラインを取り扱うことを可能にします。この方法は、真空ポンプ、消耗品、プラスチック製品などの広く利用可能な基本的な実験室機器に依存しています。この改良された方法は、シロイヌナプシスおよび他の非モデル植物種における近代的な機能的ゲノミクスアプローチに十分なスループットを備えた種子表面滅菌を合理化するための安全でシンプルで手頃な価格のアプローチを科学界に提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
種子の滅菌は、シロイヌナズナの機能研究の基本的なステップです。多くの異なる目的のために頻繁に行われますが、シロイヌズナでのハイスループット種子表面滅菌に関する限定的な研究が可能です。
これまで、最も高いスループットを有する方法の1つは、漂白剤と濃縮HClを混合して発生した塩素ガスを用いることで行なわれた。この方法は、限られた実務時間を必?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、フォンダツィオーネ・E・マッハのエコゲノミクス・グループのコア・ファンドを通じてトレント自治州から資金提供を受けた。
Materials
| Aquarium valve | Amazon | B074CYC5SD | Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip |
| Arabidopsis Col-0 wild-type seeds | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type seeds (sensitive to kanamycin) |
| Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds | NA | NA | Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds |
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa | M0222 | Standard medium for plant sterile culture |
| Pipette controller | Brand | 26300 | Used to operate the serological pipette |
| Polyethylene tube 1 | Roth | 9591.1 | Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm) |
| Polyethylene tube 2 | Roth | 9587.1 | Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm) |
| Screw cap with connectors | Roth | PY86.1 | 2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle |
| Serological pipette | Brand | 27823 | Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead |
| Shakeret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker. |
| Technical ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Non-ionic detergent acting as surfactant |
| Universal tubing connectors | Roth | Y523.1 | Can be used to improve/simplify tubing connections |
| Vacuum pump | Merck Millipore | WP6222050 | Used for making the suction device |
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