Her præsenterer vi en protokol til isolering af kerner af høj kvalitet fra frosne musenyrer, der forbedrer repræsentationen af medullære nyrecelletyper og undgår genekspressionsartefakter fra enzymatisk vævsdissociation.
Nyrerne regulerer forskellige biologiske processer såsom vand, elektrolyt og syre-base homeostase. Fysiologiske funktioner i nyrerne udføres af flere celletyper arrangeret i en kompleks arkitektur på tværs af organets kortikondedullære akse. Nylige fremskridt inden for enkeltcelletranskriptomics har fremskyndet forståelsen af celletypespecifik genekspression i nyrefysiologi og sygdom. Imidlertid kræver enzymbaserede vævsdissociationsprotokoller, som ofte anvendes til enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq), for det meste frisk (ikke-arkiveret) væv, introducerer transkriptionelle stressresponser og favoriserer udvælgelsen af rigelige celletyper i nyrebarken, hvilket resulterer i en underrepræsentation af celler i medulla.
Her præsenterer vi en protokol, der undgår disse problemer. Protokollen er baseret på kerneisolering ved 4 °C fra frosset nyrevæv. Kerner er isoleret fra et centralt stykke af musenyren, der består af cortex, ydre medulla og indre medulla. Dette reducerer overrepræsentationen af kortikale celler, der er typiske for helnyreprøver til fordel for medullære celler, således at data vil repræsentere hele kortikodedullaksen ved tilstrækkelig overflod. Protokollen er enkel, hurtig og tilpasningsdygtig og giver et skridt i retning af standardisering af enkeltkerner transkriptomik i nyreforskning.
Nyrer viser en meget kompleks vævsarkitektur. De består af funktionelt og anatomisk forskellige segmenter langs en kortikodedullær akse og medierer biologiske funktioner, såsom regulering af ekstracellulært væskevolumen, elektrolytbalance eller syre-base homeostase1.
Fremskridt inden for enkeltcelletranskriptomik har muliggjort dybdegående karakterisering af komplekse væv og fremskyndet forståelsen af segment- og celletypespecifik genekspression i nyrefysiologi, udvikling og sygdom 2,3,4.
Imidlertid viser de enzymbaserede dissociationsprotokoller, der ofte anvendes til scRNA-seq, flere ulemper og begrænsninger. Afhængigt af protokollen genererer de transkriptionelle stressresponser og vævsdissociationsbias mod kortikale celletyper, der er lettere at dissociere, 5,6. Selvom protokoller, der bruger koldaktive proteaser til embryonale nyrer, er i stand til at afbøde stressrelaterede transkriptionelle ændringer, undlader de at overvinde dissociationsbias mod kortikale celler og kan muligvis ikke let tilpasses forskellige slags syge nyrevæv7. Desuden er enkeltcellemetoder ikke let kompatible med frosne vævsprøver, idet deres anvendelse hovedsagelig begrænses til ikke-arkiveret, frisk væv, hvilket gør vævsindsamlingen til en begrænsende faktor6.
Enkeltkerne RNA-sekventering (snRNA-seq) kan omgå disse begrænsninger 8,9. Her præsenterer vi en protokol for kerneisolering fra en central skive frosset voksent musenyrevæv (figur 1)10. Vores protokol er enkel og giver en standardiseret tilgang til opnåelse af RNA-sekventeringsbiblioteker med en afbalanceret repræsentation af forskellige nyrecelletyper til eksperimentelle modeller, der ikke involverer stærke regionale vævsændringer. I sidstnævnte tilfælde kan vores protokol også udføres med hele nyrerne.
Enkeltcelletranskriptomics fremmer forståelsen af celletypespecifik genekspression i nyrefysiologi og sygdom. Her leverede vi en enkel og reproducerbar metode til at isolere enkeltkerner af høj kvalitet fra frosset musenyrevæv til snRNA-seq på en standardiseret måde.
For snRNA-seq er det afgørende at bruge kerner af høj kvalitet som input til biblioteksgenerering og for at undgå RNA-nedbrydning under vævsbehandling. Derfor er inkubation af vævsstykker i RNA-stabiliseringsopløsning umiddelbart efter dissektion afgørende for at beskytte og stabilisere cellulært RNA og gør det muligt at opbevare prøver ved – 80 ° C på ubestemt tid. Ved anvendelse af denne protokol på frosset væv uden RNA-stabiliseringsopløsningsbehandling, såsom arkivmateriale, kræves en prøvekørsel, og RNA-kvaliteten skal vurderes, da vi observerede et signifikant tab af RNA-integritet i snapfrosset væv uden forudgående inkubation i RNA-stabiliseringsopløsning.
Generelt er passende prøvehåndtering afgørende for at maksimere genvindingen af intakte, enkelte kerner. Alle trin i opslæmningen skal udføres omhyggeligt ved pipettering for at undgå forskydningsspænding og fysisk skade. Buffere til den endelige kerneresuspension og kernesortering bør indeholde BSA for at undgå kernetab og aggregering.
Buffervolumener i denne protokol er optimeret til meget små vævsprøver (~15 mg). Det er afgørende at sikre fuldstændig cellelyse og tilstrækkelig vask til at generere suspensioner af høj kvalitet. Større vævsblokke eller hele nyreprøver vil resultere i for høje kernekoncentrationer, der fører til klumpning og aggregering, høj overflod af omgivende RNA og generelt dårlig suspensionskvalitet. Hvis større prøver eller andet væv behandles, anbefales det stærkt at udføre prøvekørsler for at bestemme optimale buffervolumener for minimale omgivende RNA-niveauer. Kerne- og RNA-kvalitet og koncentrationer skal undersøges nøje, da overbelastning resulterer i generelt dårlig ydeevne.
Derudover påvirker store mængder celleaffald, der forårsager høje niveauer af omgivende RNA, der ikke er forbundet med enkeltkerner, sekventeringsresultaterne negativt. Afklaring af kernesuspensionen ved centrifugering gennem en saccharosepude afbøder dette problem til en vis grad, men det kan også føre til bias i celletyperepræsentation ved modselektion mod tætte, små kerner, der f.eks. er til stede i immunceller16. Hvis dette giver anledning til bekymring, bør saccharosegradienten udelades. I modsætning hertil fandt vi, at flowcytometri baseret på DAPI-farvning var afgørende for at reducere mængden af celleaffald for at producere en enkeltkernesuspension af høj kvalitet.
Isolering af enkeltkerner har betydelige fordele sammenlignet med enkeltcellemetoder8. Det er kompatibelt med korrekt frosset væv, hvilket gør vævssamlingen mere fleksibel og omgår behovet for enzymbaseret vævsdissociation, som kan introducere transkriptionelle stressresponser 6,17. Desuden overvinder det dissociationsbias, der favoriserer udvælgelsen af let dissocierbare celletyper i nyrebarken, hvilket kan føre til en underrepræsentation af medullære celletyper i nogle enzymbaserede tilgange 5,6,10.
Brug af et centralt nyrestykke i stedet for hele nyrevæv sparer yderligere ressourcer og korrigerer for overrepræsentation af rigelige celletyper som beskrevet tidligere10. Afhængigt af den undersøgte musemodel eller fænotype kan det dog være en fordel at bruge hele nyreprøver i stedet for en enkelt midterste skive. Hele nyreprøver kan være mere repræsentative for ægte celleproportioner eller ændringer, der forekommer i hele nyrerne, mens en trimmet midterste skive viste sig fordelagtig for medullære fænotyper, eller når prøvematerialet var begrænset. Denne beslutning er derfor meget brugerspecifik og bør overvejes nøje.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Scientific Genomics Platform på Max Delbrück Center for Molecular Medicine i Helmholtz Association, Berlin for teknisk support.
JL og KMSO blev støttet af German Research Foundation (DFG) Research Training Group GRK 2318 og af Research Unit FOR 2841. KMSO blev støttet af Collaborative Research Grant 1365. AB blev støttet med midler fra Gottfried Wilhelm Leibniz-prisen fra DFG, der blev tildelt NR.
Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
Ethanol, 70 % | – | – | |
FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
Razor blades | – | – | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |