Detta protokoll syftar till att beskriva hur man studerar omfattningen av Staphylococcus aureus internalisering och dess förmåga att överleva inuti den mänskliga värdcellen, liksom den intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar.
Staphylococcus aureus uttrycker virulensfaktorer för att utlösa dess internalisering i eukaryoteceller och för att överleva inuti olika subcellulära fack. Detta dokument beskriver en enzym skydd analys för att studera omfattningen av S. aureus internalisering och dess intracellulära överlevnad i vidhäftande icke-professionella fagocytic celler (NPPCs) samt intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar. NPPCs odlas i en multi-well plate tills de når 100% sammanflöde. S. aureuskulturer odlas över en natt i cellodlingsmedium. Bakteriesuspensionen späds ut enligt antalet celler per brunn för att inokulera cellerna vid en kontrollerad multiplicitet av infektion. Inokulerade celler inkuberas i 2 timmar för att bakterierna ska kunna internaliseras av NPPCs, varefter lysostaphin tillsätts till odlingsmediet för att selektivt döda extracellulära bakterier. Lysostaphin finns i odlingsmediet för resten av experimentet.
Vid denna tidpunkt kan de infekterade cellerna inkuberas med antimikrobiella föreningar för att bedöma deras intracellulära aktiviteter mot S. aureus. Därefter tvättas cellerna tre gånger för att ta bort drogerna, och intracellulär S. aureusbelastning kvantifieras sedan genom odling på agarplattor. Alternativt, för att studera stafylokock virulensfaktorer som är involverade i intracellulär överlevnad och celltoxicitet, lysostaphin kan inaktiveras med proteinas K för att eliminera behovet av tvätt steg. Detta tips förbättrar tillförlitligheten hos intracellulär bakteriell belastning kvantifiering, särskilt om celler tenderar att lossna från odlingsplattan när de blir kraftigt infekterade på grund av multiplikation av intracellulära S. aureus. Dessa protokoll kan användas med praktiskt taget alla typer av vidhäftande NPPCs och med 3D-cellkulturmodeller som organoider.
Staphylococcus aureus är både en livshotande patogen och en kommensal bakterie av huden och slemhinnan som koloniserar två miljarder individer runt om i världen1. Hos människor har nasala bärare av S. aureus en ökad risk för infektion med sin egen stam av transport; De multifaktoriella bestämningsfaktorerna för S. aureus mucosal carriage är dock fortfarande oklara1,2. Förutom akuta infektioner kan patienter också utveckla kroniska S. aureusinfektioner som ofta är utmanande att bota3. En bättre förståelse för värd-patogen interaktioner under kolonisering och infektion är avgörande för att utveckla nya terapeutiska strategier och förbättra patienthantering.
In vitro kan S. aureus utlösa dess internalisering i värdceller som uttrycker α5β1 integrin4. Trepartsinteraktion mellan stafylokockfiboccal fibronectin-bindande proteiner förankrade i cellväggen av S. aureus, fibronektin och β1 integrin uttryckt på värdcellens yta är välkänd som den viktigaste vägen för S. aureus internalisering i NPPCs såsom keratinocyter, osteoblaster, fibroblaster och epitelial och endotel celler4. Nyligen genomförda studier visar att S. aureus kan hittas inuti mänskliga celler under nasal kolonisering5,6 och infektion7. Rollen av intracellulära reservoaren i patogenesen vid S. aureus infektion är dock oklart. Värdcellerna kan fungera som ett skydd för S. aureus, som är skyddad från både immunsystemet8 och de flesta antimikrobiella föreningar6,9.
Lysostaphin skyddsanalysen, som beskrevs av Proctor10 tidigare på 1980-talet, möjliggör studier av bakteriella och värdfaktorer involverade i internaliseringen av S. aureus isolat. Lysostaphin är en bakteriin som produceras av Staphylococcus simulaner, som uppvisar potent aktivitet mot nästan alla S. aureus isolat, inklusive antibiotikaresistenta stammar11. Lysostaphin har använts för att förstöra endast extracellulärA S. aureus för att möjliggöra räkning av endast livskraftiga intracellulära bakterier12. Denna teknik har använts i stor utsträckning och har bidragit till upptäckten av flera virulensfaktorer av S. aureus. Gentamycin, ensam och kombinerad med lysostaphin, används också ofta för att studera intracellulära bakterier.
En ny studie visade dock att gentamycin kommer in i eukaryota celler och når internaliserade bakterier på ett tids- och koncentrationsberoende sätt13. Denna studie visade också att lysostaphin inte kommer in i eukaryota celler, vilket bekräftar att en lysostaphinbaserad enzymskyddsanalys (EPA) är den mest exakta analysen för kvantifiering av intracellulär S. aureus belastning av kultur13. Oavsett vilken förening som används för att förstöra extracellulära bakterier (t.ex. lysostaphin eller gentamycin) ska den avlägsnas genom att cellerna tvättas innan de pläterar intracellulärA S. aureus på agarplattor. Successiva tvättar kan leda till att celler, särskilt dåligt vidhäftande celler (t.ex. kraftigt infekterade celler), vilket skulle leda till en underskattning av den intracellulära S. aureusbelastningen . Detta dokument beskriver i detalj hur EPA kan användas för att kvantifiera intracellulära S. aureus belastning och för att mäta intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar föreningar med hjälp av en in vitro-modell . Observera att en enkel metod har föreslagits för att förbättra tillförlitligheten hos intracellulär belastning kvantifiering genom att undvika intensiva tvättar.
De analyser som beskrivs här är värdefulla för att studera omfattningen av internalisering och intracellulär överlevnad av S. aureus i NPPCs, liksom den intracellulära effekten av antimikrobiella föreningar6,15,16. Vissa steg i båda analysprotokollen kan vara kritiska. Cellernas hälsotillstånd och densitet måste vara perfekt kontrollerade och konsekventa mellan oberoende experiment. Bakteriell inokulat måste noggrant standardiseras för att få en riktig MOI nära den riktade teoretiska MOI. I allmänhet måste man vara försiktig så att ingen av cellerna lossnar under pipettering. Tvättar för att ta bort lysostaphin och antibiotika är kritiska steg i EPA. Användningen av proteinas K har visat sig förbättra detta steg när inget antibiotikum används (se nedan). Sist men inte minst bör cellerna vara helt fristående i varje brunn och noggrant homogeniseras efter inkubationen med lysbufferten för att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera S. aureus intracellulär belastning.
I vissa fall kan problem uppstå och flera punkter måste kontrolleras först. Vid brist på reproducerbarhet måste man komma ihåg att S. aureus kan bilda klumpar, vilket gör kvantifiering genom absorbans felaktig. Klumpar av bakterier kan ökas genom centrifugering och tvättsteg om odlingsmediet ska bytas ut (t.ex. för att eliminera ett utsöndrat protein). Bakteriesuspensionen bör användas snabbt eftersom bakterier fortsätter att växa i rumstemperatur. Lysostaphin effekt kan minska på grund av felaktiga lagringsförhållanden, suboptimala pH för enzym aktivitet i odlingsmediet, variabilitet i enzymatisk aktivitet mellan partier och leverantörer och brist på lysostaphin känslighet av vissa stammar i specifika tillväxtförhållanden. Fenolrött kan ha en liten bakteriostatisk effekt, särskilt när odlingsmediet är relativt dåligt i näringsämnen jämfört med de typiska buljonger som används för odling av bakterier. Således är det lämpligt att använda ett cellodlingsmedium utan fenolrött, vilket också förbättrar fluorescens mikroskopiska observationer genom att minska bakgrundsljudet.
Även om denna metod är ett värdefullt verktyg för att studera det intracellulära ödet för olika stammar, bör vissa gränser för metoden övervägas. Användningen av en mycket hög MOI kan överbelasta förmågan till internalisering av NPPCs och utjämna skillnaderna mellan de olika stammar som testas. Omfattningen av internalisering av de mest cytotoxiska stammarna kan underskattas eftersom lysostaphin (eller antibiotika) snabbt förstör S. aureus som frigörs av skadade celler. Således är experiment med förlängd varaktighet (dvs. att studera intracellulär överlevnad eller intracellulär aktivitet av antibiotika) lättare att sätta upp med stammar med låg cytotoxicitet. Därför bör inkubationstiden och MOI justeras noggrant efter stammen virulens, celltyp och experimentellt syfte.
Metoden som beskrivs här med användning av lysostaphin är mer tillförlitlig än de som är baserade på gentamicin eftersom gentamicin, till skillnad från lysostaphin, tenderar att internaliseras av värdceller13. Den andra fördelen är möjligheten att inaktivera lysostaphin. Hämning av lysostaphin aktivitet rapporterades av Kim et al.13 med användning av EDTA för att kelatera zinkjoner eller 1,10-fenantropolin; Intensiva tvättar krävs dock fortfarande för att avlägsna enzymet före plätering av bakterierna. Här möjliggör proteinas K snabb inaktivering av lysostaphin. Vi observerade att celler tenderar att lossna från kulturplattan när de blir kraftigt smittade på grund av multiplikation av intracellulära S. aureus. Genom att hoppa över det sista tvättsteget förenklade iEPA-metoden den tekniska hanteringen avsevärt och möjliggjorde återvinning av de internaliserade bakterierna i löst vidhäftande eller redan fristående celler.
De mer koncentrerade reagenserna och buffertarna som används i iEPA bidrog också till att minska pipetteringsinsatsen och minimera förlusten av celler. Dessutom kan iEPA användas med celler i suspension, liksom med organoider som är svåra att tvätta. Sammanfattningsvis möjliggör enzymskyddsanalyser studien av internaliseringens omfattning och S. aureus intracellulära öde, liksom intracellulär aktivitet av antimikrobiella läkemedel med olika in vitro-modeller . Förbättringar bör göras för att bättre karakterisera förhållandet mellan internalisering och cytotoxicitet för att bättre förstå vikten av att utveckla läkemedel som kan nå S. aureus inuti cellen.
The authors have nothing to disclose.
S. aureus stammar SF8300 WT och SF8300 ΔfnbA/B var generöst begåvade av Prof. Binh Diep (University of California, San Francisco, USA). Detta arbete stöddes av ett bidrag från FINOVI-föreningen (#AO13 FINOVI) under ledning av stiftelsen för universitetet i Lyon.
24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
Sterile water | OTEC | 600500 | |
T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |