ताजा पृथक माउस हेपेटोसाइट्स के निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण का मापन
Summary
फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण एक आवश्यक चयापचय मार्ग है जो हेपेटोसाइट्स सहित कई अलग-अलग सेल प्रकारों में ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए जिम्मेदार है। यहां, हम 14सी-लेबल वाले पामिटिक एसिड का उपयोग करके ताजा पृथक प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण को मापने की एक विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण यकृत की ऊर्जा मांगों को पूरा करने और अतिरिक्त प्रक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और कॉफ़ैक्टर्स प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण चयापचय मार्ग है, जैसे कि कीटोजेनेसिस और ग्लूकोनोजेनेसिस, जो पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टेसिस को बनाए रखने और उपवास की स्थिति में अतिरिक्त-यकृत अंग समारोह का समर्थन करने के लिए आवश्यक हैं। फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण माइटोकॉन्ड्रिया और पेरोक्सीसोम के भीतर होता है और कई तंत्रों के माध्यम से विनियमित होता है, जिसमें फैटी एसिड, एंजाइम अभिव्यक्ति के स्तर और कोएंजाइम ए और एनएडी + जैसे कॉफ़ैक्टर्स की उपलब्धता और सक्रियण शामिल है। यकृत होमोजेनेट्स, सेल लिसिस में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण को मापने वाले परखों में और कॉफ़ैक्टर्स के सुपरफिजियोलॉजिकल स्तरों के सामान्य जोड़ इन नियामक तंत्रों के प्रभावों को मुखौटा करते हैं। इसके अलावा, होमोजेनेट्स में ऑर्गेनेल की अखंडता को नियंत्रित करना मुश्किल है और तैयारी के बीच काफी भिन्न हो सकता है। बरकरार प्राथमिक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण का माप उपरोक्त नुकसान को दूर करता है। यह प्रोटोकॉल 14सी-लेबल वाले पामिटिक एसिड के साथ ऊष्मायन ताजा पृथक प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स के निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण के माप के लिए एक विधि का वर्णन करता है। संस्कृति के दिनों के घंटों से बचने से, इस विधि में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर और मूल यकृत की चयापचय मार्ग गतिविधि को बेहतर ढंग से संरक्षित करने का लाभ होता है, जिसमें खिलाए गए चूहों की तुलना में उपवास वाले चूहों से पृथक हेपेटोसाइट्स में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण की सक्रियता शामिल है।
Introduction
फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण लिपिड चयापचय में एक आवश्यक प्रक्रिया है, जो फैटी एसिड संश्लेषण और आहार से सेवन को संतुलित करने के लिए एक अपचय मार्ग प्रदान करता है। यह प्रक्रिया हृदय की मांसपेशियों, गुर्दे के प्रांतस्था और उपवास यकृत सहित कई अंगों के लिए ऊर्जा उत्पन्न करती है, और आहार, वसा ऊतक लिपोलिसिस और आंतरिक ट्राइग्लिसराइड स्टोर 1,2 से प्राप्त फैटी एसिड का उपयोग करती है।
β-ऑक्सीकरण मार्ग के माध्यम से फैटी एसिड के ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप एक समय में दो कार्बन द्वारा फैटी एसाइल श्रृंखला का अनुक्रमिक छोटा होना होता है, जिसे एसिटाइल-सीओए के रूप में जारी किया जाता है, और यह प्रक्रिया माइटोकॉन्ड्रिया और पेरोक्सीसोम दोनों में होती है। जबकि अधिकांश फैटी एसिड केवल β-ऑक्सीकरण से गुजरते हैं, कुछ इस मार्ग में प्रवेश करने से पहले विभिन्न कार्बन पर ऑक्सीकरण होते हैं। उदाहरण के लिए, 3-मिथाइल-प्रतिस्थापित फैटी एसिड, जैसे कि फाइटेनिक एसिड, β-ऑक्सीकरण मार्ग में प्रवेश करने से पहले पेरोक्सीसोम में α-ऑक्सीकरण द्वारा एक कार्बन को हटाने से गुजरते हैं। इसी तरह, कुछ फैटी एसिड को पहले एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में टर्मिनल मिथाइल समूह (ω-ऑक्सीकरण) के ऑक्सीकरण द्वारा डाइकारबॉक्सिलिक फैटी एसिड में परिवर्तित किया जाता है, इससे पहले कि β-ऑक्सीकरण3 द्वारा पेरोक्सीसोम में अधिमानतः ऑक्सीकरण किया जाता है।
विशिष्ट ऑर्गेनेल के बावजूद, एक फैटी एसिड को पहले कोएंजाइम ए (सीओए) थियोस्टर, या एसाइल-सीओए में परिवर्तित किया जाना चाहिए, ताकि β-ऑक्सीकरण मार्ग के माध्यम से ऑक्सीकरण किया जा सके। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में लंबी श्रृंखला एसाइल-सीओए के β-ऑक्सीकरण के लिए कार्निटाइन शटल की आवश्यकता होती है, जहां कार्निटाइन पामिटॉयलट्रांसफेरेज़ 1 (सीपीटी 1) एसाइल-सीओए के एसाइलकार्निटाइन में रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है और इस प्रक्रिया में दर-सीमित एंजाइम है4. एक बार माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में स्थानांतरित होने के बाद, एसाइल-सीओए को फिर से बनाया जाता है और माइटोकॉन्ड्रियल β-ऑक्सीकरण मशीनरी के लिए सब्सट्रेट के रूप में काम करता है। उपवास की स्थिति में, यकृत माइटोकॉन्ड्रिया में β-ऑक्सीकरण के माध्यम से उत्पादित एसिटाइल-सीओए मुख्य रूप से केटोजेनेसिस के लिए चैनल किया जाता है। पेरोक्सीसोम बहुत लंबी श्रृंखला, शाखित-श्रृंखला और डाइकारबॉक्सिलिक फैटी एसिड के β-ऑक्सीकरण के लिए प्राथमिक साइट के रूप में कार्य करते हैं। पेरोक्सीसोम को फैटी एसिड सब्सट्रेट आयात करने के लिए कार्निटाइन शटल की आवश्यकता नहीं होती है, इसके बजाय एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर एबीसीडी 1-35 की गतिविधि के माध्यम से संवाददाता एसाइल-सीओए आयात करते हैं। पेरोक्सीसोम के भीतर, एसाइल-सीओए को तब एंजाइमों के एक समर्पित सेट द्वारा ऑक्सीकरण किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण मशीनरी से अलग होता है। माइटोकॉन्ड्रिया और पेरोक्सीसोम दोनों को फैटी एसाइल श्रृंखलाओं को ऑक्सीकरण करने के लिए एनएडी + और मुक्त सीओए की आपूर्ति की भी आवश्यकता होती है। यकृत में सीओए के स्तर को उपवास के जवाब में वृद्धि के लिए दिखाया गया है, जो फैटी एसिड ऑक्सीकरण की बढ़ी हुई दर का समर्थन करता है जो इस राज्य में होता है6. इसके अलावा, पेरोक्सिसोम में सीओए गिरावट में वृद्धि के परिणामस्वरूप पेरोक्सिसोमल फैटी एसिड ऑक्सीकरण में चयनात्मक कमी होती है7. इसलिए, कोशिका के भीतर फैटी एसिड ऑक्सीकरण की प्रक्रिया को फैटी एसिड के सक्रियण, परिवहन और ऑक्सीकरण में शामिल एंजाइमों की अभिव्यक्ति के स्तर और गतिविधियों के साथ-साथ कई उपकोशिकीय डिब्बों में कॉफ़ैक्टर्स और अन्य चयापचयों की सांद्रता द्वारा विनियमित किया जाता है।
फैटी एसिड ऑक्सीकरण को मापने के लिए ऊतक होमोजेनेट्स का उपयोग करने वाली प्रक्रियाएं इस प्रक्रिया को विनियमित और समर्थन करने वाले सेलुलर आर्किटेक्चर को नष्ट कर देती हैं, जिससे डेटा का संग्रह होता है जो विवो चयापचय में सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करता है। जबकि मढ़वाया प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करने वाली तकनीकें इस प्रणाली को संरक्षित करती हैं, विस्तारित अवधि के लिए पृथक कोशिकाओं को संवर्धन करने से इन विवो जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का नुकसान होता है जो कोशिकाओं में मौजूद था जब वे अभी भी जानवर 8,9 के भीतर रह रहे थे। निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्राथमिक हेपेटोसाइट्स को अलग करने और [1-14सी] पामिटिक एसिड का उपयोग करके अलगाव के तुरंत बाद और निलंबन में फैटी एसिड β-ऑक्सीकरण के लिए उनकी क्षमता परख करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। परख एसिड-घुलनशील चयापचयों (एएसएम) या एसिटाइल-सीओए जैसे उत्पादों से जुड़ी रेडियोधर्मिता के माप पर आधारित है, जो [1-14 सी] पामिटिक एसिड10,11 के β-ऑक्सीकरण द्वारा उत्पादित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यकृत छिड़काव के दौरान, हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे यकृत में माइक्रोकेशिकाओं को अवरुद्ध करते हैं, बफर परिसंचरण को रोकते हैं या प्रतिबंधित करते हैं और समग्र रूप से हेपेटोस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को रॉबर्टा लियोनार्डी को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ अनुदान आर 35 जीएम 119528 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
References
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