본 프로토콜은 마취된 돼지에서 일반적인 비골 신경의 전기 자극을 통해 얻어진 생체내 토크 데이터의 평가 및 해석에 대한 간결한 실험 세부사항을 기술한다.
골격근 강도의 신뢰할 수있는 평가는 신경 근육 및 근골격계 질환 및 부상 연구, 특히 재생 요법의 효능을 평가할 때 가장 중요한 결과 측정이라고 할 수 있습니다. 또한 많은 재생 요법을 번역하는 데 중요한 측면은 대형 동물 모델에서 확장 성과 효과를 입증하는 것입니다. 기초 과학 연구에서, 주로 작은 동물 모델에서 내재적 근육 기능 특성을 평가하기 위해 다양한 생리 학적 제제가 확립되었습니다. 상기 관행은 다음과 같이 분류될 수 있다: 시험관 내(단리된 섬유, 섬유 다발, 또는 전체 근육), 계내 (무손상 혈관화 및 신경과민을 갖는 근육이지만 힘 변환기에 부착된 원위 힘줄이 있는 근육), 및 생체내 (근육 또는 근육 유닛의 구조는 온전하게 유지됨). 이러한 각 준비에는 강점과 약점이 있습니다. 그러나, 생체내 강도 테스트의 분명한 이점은 동일한 동물에서 반복 측정을 수행할 수 있다는 것이다. 본원에서, 마취된 돼지에서 표준 회음부 전기 자극에 반응하여 생체 내에서 뒷다리 등쪽 굴곡기 근육에 의해 생성된 등각 토크를 신뢰성 있게 평가하기 위한 재료 및 방법이 제시된다.
골격근의 주요 기능은 궁극적으로 호흡, 식사 및 외래와 같은 활동을 가능하게하는 힘을 생성하는 것입니다. 골격근 기능 능력을 감소시키는 조건은 성능 저하 (직업 또는 스포츠), 장애 또는 사망으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 고령화 인구에서 근육량과 기능의 유지는 삶의 질과 일상 생활의 기본 및 도구 활동을 수행 할 수있는 능력과 긍정적으로 관련이 있습니다 1,2. 그리고, Duchenne 근이영양증 환자에서 근력이 감소하면 외래 및 호흡 부전이 불가능 하여 궁극적으로 조기 사망률 3,4,5에 기여합니다. 따라서, 근력 측정은 신경근 질환 또는 손상과 관련된 연구에서 중요한 결과 측정이다.
최대 자발적 등각 또는 등동역학 토크 (및/또는 피로 지수)는 종종 임상 연구6에서 기능적 능력의 지표로 사용된다. 동물 연구에서, 유사한 측정은 마취 상태에서 전기 신경 자극을 사용하여 생체 내에서 수행 될 수 있습니다. 특히, 생체내 제제는 근육조직, 힘줄, 혈관조직 및 신경과민이 온전하게 남아 있는 최소 침습적이며, 따라서 반복적인 기능적 평가(7,8,9,10,11)를 허용한다. 이 제제는 일반적으로 작은 설치류 모델에서 사용되며 토끼 12, 개 13,14, 양15 및 돼지 16,17과 같은 더 큰 동물 모델에서는 덜 사용됩니다. 이러한 방법론의 일반적인 사용은 척추 근육 위축 (SMA)18의 유전자 조작 돼지 (돼지) 모델과 같은 많은 번역 연구 연구에 영향을 줄 수 있습니다. 본원에서, 생체내에서 돼지 등굴곡기 근육 그룹의 신경 자극-유도된 최대 등각 토크를 평가하는 방법이 제시된다. 제시된 기술은 처음에는 마우스 전방 crural 근육 토크19,20을 평가하기 위해 원래 개발 된 기술에서 채택되었으며 이후 부상 후 토크 생성 능력을 조사한 경험을 통해 정제되었습니다 17,21,22,23,24,25,26,27,28 그리고 다양한 돼지 모델에서 개발16 동안.
이 프로토콜은 로드셀 및 전기 자극기와 통합된 컴퓨터가 필요한 방법론을 사용한 생체 내 등각 토크 측정을 강조합니다. 여기에 제시된 방법은 상업적으로 이용 가능한 통합 돼지 아이소메트릭 풋플레이트 테스트 장치, 플랫폼 장치 및 해당 소프트웨어를 사용합니다( 재료 표 참조). 그러나, 방법론은 다른 상업적으로 이용가능하거나 맞춤형으로 만들어진 소프트웨어, 데이터-획득 장치, 및 자극기를 사용하도록 적응될 수 있다. 이러한 방법은 수술 테이블 잠금, 테스트 플랫폼을위한 동일한 높이의 두 번째 잠금 테이블, 인공 호흡기 및 모니터링 장치, 체온을 유지하기위한 가열 매트 또는 기타 장치와 같은 표준 장비로 가득 찬 전용 대형 동물 수술 스위트에서 사용하기위한 것입니다.
이러한 방법을 수행하려면 다음 팀원이 필요합니다 : 기능 테스트를 수행하기 위해 숙련 된 마취 기술자 한 명과 연구 인력 두 명. 이 사람들은 플랫폼 장치에서 사지의 초기 안정화를 위해 함께 일할 것입니다. 그런 다음 두 직원 중 한 명이 전극 배치 / 포지셔닝을 담당하고 다른 한 명은 테스트 중에 컴퓨터 응용 프로그램을 담당합니다.
중요한 단계, 수정 및 문제 해결
데이터 변동성을 최소화하고 접근 방식의 성공을 극대화하기 위해 다음과 같은 중요한 단계가 강조 표시됩니다.
최적의 신경 자극
이 실험적 접근법은 신경 축삭 탈분극으로 시작하여 올바른 전극 배치와 최적화 된 전기 자극에 의존합니다. 뼈가 많은 랜드 마크와 관련된 신경 해부학의 사후 분석은 테스트 중에 적절한 전극 배치를 시각화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최대 트위치 토크를 획득하면 신경 축삭에 전달되는 적절한 전류(밀리암페어 단위; mA)를 결정하는 데 도움이 됩니다. 테스트 시작시 신경 자극을 최적화할 때 명심해야 할 두 가지 값이 있습니다: (1) 트위치 대 파타닉 비율은 ~1:5, 예를 들어, ~2 N·m 트위치 토크는 10 N·m 파타닉 토크에 해당합니다 (그림 3); (2) 체질량에 대한 일반적인 토크는 체질량 kg 당 ~0.3N·m이다(그림 4). 피크 트위치 토크가 낮게 나타나면 전극을 제거하고 다른 배치를 시도하십시오. 자극기 설정, BNC 연결 및 전극 연결을 확인하십시오. 위에서 언급한 바와 같이 관절 각도 사이의 사지를 위치시키는 동안 너무 많은 움직임이 있는 경우 수축 사이에 전극 재배치가 필요할 수 있습니다(그림 2). 실험적 및 중재적 접근법이 이러한 값에 영향을 줄 수 있다는 점에 유의하십시오.
적절한 생체 역학적 정렬
시작 근육 길이는 근육 수축력 (길이 – 긴장 관계)에 영향을 미치며 근육 길이는 엉덩이, 무릎 및 발목 관절 정렬에 따라 변경 될 수 있습니다. 관절 각도는 팔다리와 돼지 사이에서 표준화되어야합니다. 90 ° 발목 관절 각도는 엉덩이와 무릎에 강력히 권장됩니다. 약간 발바닥 굴곡 발목 위치 (중립 0 ° 발목 관절 각도에서 ~ 30 °)는 피크 강도에 최적입니다. 그것은 서있는 동안 돼지와 개 모두에서 발목 관절의 자연 해부학 적 위치를 반영합니다. 또한 모든 조인트는 수직 토크 벡터의 기여로 인한 측정 가능한 토크의 손실을 피하기 위해 풋 페달 및 토크 트랜스듀서와 평행해야 합니다. 엉덩이-무릎-발목 관절 각도와 발-페달-관절 정렬을 검사하는 것은 발을 발 페달로 고정하고 사지 클램핑 막대로 무릎 관절을 고정한 후에 강력하게 권장됩니다(그림 1). 정렬이 잘못되면 막대를 잠금 해제하고 제거하고 수술 테이블에 돼지를 재배치하십시오. 연구 전반에 걸쳐 관절 각도를 표준화하는 것이 데이터 분산을 최소화하는 데 중요하지만, 아래에서 논의되는 생체 역학적 정렬에는 한계가 있습니다.
기존 또는 대체 방법과 관련된 중요성
돼지 모델에 사용될 수 있는 근육 기능에 대한 임상적으로 관련성이 높고 비침습적인 평가의 변경적인 예에는 디딜방아 보행 거리, EMG 및 활성 근육 전단파 전기가 포함된다. 인간에서 6 분 도보 테스트로서, 러닝 머신 보행 테스트는 대형 동물 33,34,35에서 질병 진행 및 개입 성공을 평가할 수 있습니다. 전형적으로, 순응 기간 후에, 동물들은 상이한 디딜방아 속도 및/또는 경사 수준에서 순응이 끝날 때까지 걸을 수 있다. 음식 보상은 종종 최대한의 동기 부여를 달성하는 데 필요합니다. 그러나 러닝 머신 보행 결과는 피험자 동기 부여, 비 최대 운동 유닛 모집 및 심혈관, 골격 및 호흡기와 같은 다른 신체 시스템에 대한 고유 한 공동 의존성과 같은 제한으로 인해 근육 수축 기능에 대한 간접적 인 해석 만 제공합니다.
반면에, EMG 전극은 관심 근육 그룹(36,37,38)에 직접 배치되기 때문에 골격근 시스템에 대한 약간 더 나은 직접 평가를 제공한다. 그런 다음 EMG 전극은 집단 근육 활동 (탈분극 된 근육 섬유)을 측정합니다. 이 근육 활동은 모터 유닛 모집 및 속도 코딩 (모집 된 모터 유닛으로 전송 된 행동 잠재력의 빈도)을 기반으로합니다. 그러나 모터 유닛 모집과 속도 코딩의 상대적 기여도를 분리하는 것은 표면 EMG에서는 불가능합니다. 또한, EMG는 최대한의 수축을 일으키려는 피험자의 의지에 의존하며, 이러한 수준의 협력은 대형 동물 모델에서는 거의 불가능합니다. 보행주기 동안 근전도의 변화를 평가하는 것이 유익 할 수 있지만, 이러한 데이터는 관심있는 골격근 그룹의 최대 기능 능력을 나타내지 않습니다. B 모드 및 전단파 엘라스토그래피를 활용한 초음파 기반 이미징은 근육 기능을 평가하는 데 사용되는 또 다른 비침습적 방식입니다. 엘라스토그래피에 의해 측정된 영 모듈러스와 증가 근육 부하39,40 사이에는 좋은 상관관계가 있다. 전단파 엘라스토그래피는 돼지 용적 근육 손실 손상 모델23을 포함하는 수동 조직 강성 41,42,43,44,45의 정량적 척도로서 검증되고 사용되었다. 이는 또한 활성 근력 생산(39)의 간접 측정으로서 사용될 수 있다. 그러나 수축을 수행하기위한 피험자 의지와 협력에 대한 EMG와 유사한 한계는 여전히 존재합니다.
여기에 기술 된 생체내 프로토콜은, 러닝머신 보행 거리 및 EMG와는 대조적으로, 근육 기능의 신뢰성, 재현성, 및 최대한의 평가를 제공한다. 이 프로토콜은 동기 부여와 독립적 인 통제되고 정량화 가능한 방식으로 근육 수축을 유발합니다. 구체적으로, 경피 전극은 중추 신경계를 우회하는 신경 축삭을 자극하기 위해 사용된다. 신경 축삭의 탈분극은 모든 운동 유닛을 참여시켜 운동 유닛 모집과 관련된 가변성을 제거합니다. 추가적으로, 조사자는 속도 코딩(자극 주파수)을 제어한다. 이 접근법에 적용되는 결과 신경 근육 생리학은 Ranvier의 노드에서 전압 게이트 된 나트륨 채널 활성화로 시작됩니다. 모든 후속 (또는 하류) 생리학은 여기 수축 결합 및 교차 브리지 사이클링을 포함하여 참여됩니다. 생체내 비침습적 근육 분석의 중요한 이점은 수축성 근육 기능이 반복적으로 측정될 수 있다는 것이다, 예를 들어, 매주, 손상, 개입, 또는 질병 진행에 걸친 후 근력을 모니터링한다.
방법의 제한 사항
이 프로토콜 에 설명된 생체내 장비는 관절 각도 및 자극 주파수의 함수로서 수동 및 능동 등각 토크를 허용한다. 사용된 시험 장치는 동적 수축(예를 들어, 동동역학적 편심 또는 동심 수축)의 측정을 지원하지 않는다. 이 장치는 토크-조인트 각도 관계를 특성화하기 위해 105° 범위의 움직임을 허용하며 최대 토크 범위가 ~50N·m인 로드셀을 사용합니다. 특정 실험 질문에는 이러한 사양 이외의 성능 특성이 필요할 수 있습니다. 주목할 만하게, 이러한 설명된 장치 상의 로드 셀은 필요하다면 더 큰 토크 범위로 교환될 수 있다.
생체내에서 최대한의 신경근 강도를 측정하기 위해 본원에 기재된 프로토콜은 주목할 만한 한계를 갖는다. 첫째,이 방법은 마취가 필요하며, 이는 동물 시설 프로토콜 및 자원에 따라 다르게 수행 될 수 있습니다. 마취제는 신경근 기능에 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 마우스의 생체내 등융곡기 토크 생성을 마취형 및 -용량-의존적 방식으로 변화시키는 것으로 나타났다(29). 큰 동물의 생체 내 토크에 대한 마취제의 차별적 인 효과는 불분명하다. 따라서, 대조군 및 실험군은 이러한 가변성을 조절하기 위해 동일한 마취제(예를 들어, 케타민을 투여한 모든 그룹)를 가져야 한다. 둘째, 생체 내 확산 패턴에 대한 의존은 수축성 기능 장애 및 급성 약물 독성의 세포 메커니즘의 탐구를 제한합니다. 예를 들어, 카페인은 단리된 근육의 시험관내 장기 목욕 시험 중에 유육종 망상 칼슘 방출을 자극하고, 여기-수축 커플링(46)을 직접 우회하여 사용될 수 있다. 이러한 효과를 유도하는 카페인의 양(mM)은 생체내 환경에서 치명적이다. 전신에 대한 약물 영향 (예를 들어, 신장 / 간 스트레스) 및 순환으로 분비되는 후속 인자는 이 접근법이 급성 근력에 대한 약물 스크리닝에 사용되는 경우 고려될 필요가 있을 것이다23. 셋째, 최대한의 전기 신경 자극의 사용은 위에서 논의 된 바와 같이 자발적인 모집 전략에서 벗어나므로 신경 근육 모집 적응으로 인한 힘의 변화를 반영하지 않습니다.
생체내 토크 측정은 또한 실험적 관찰을 위한 특정 메카니즘을 확립하는 것과 관련하여 제한될 수 있다. 예를 들어, 발목 관절에 대한 토크는 근육력 생산뿐만 아니라 힘줄과 관절 및 결합 조직 특성에도 달려 있습니다. 또한, 힘은 근육 그룹, 특히 돼지의 발바닥 굴곡기 (위장병, 발바닥 및 질경이 근육)와 등쪽 굴곡기 (peroneus tertius, tibialis 및 digitorum muscles)에 의해 생성됩니다. 따라서 최대한의 생체 내 토크 데이터의 해석은 잠재적 인 근육 및 해부학 적 변화를 고려해야하며 개별 근육이 아닌 근육 그룹으로 제한됩니다. 이와 관련하여, 근육 그룹은 종종 발바닥 굴곡기의 위장관 및 발바닥 근육과 같은 우세하게 빠른 근육 섬유와 느린 근육 섬유의 혼합물로 구성됩니다. 수축 및 이완의 속도 (또는 피크 수축 시간 및 반-이완 시간)와 같은 수축 특성은 시험관내 또는 현장 테스트 프로토콜47과 같은 단리된 근육 제제 대 생체내 사용을 사용하는 섬유 유형 생리학의 신뢰할 수있는 지표가 아닙니다. 분리 된 근육 제제는 또한 근육 길이와 같은 특성을 정확하게 제어 할 수 있기 때문에 생체 역학 매개 변수가 근육 기능에 미치는 영향을 이해하는 데 탁월합니다. 관절 각도-토크 관계는 힘줄(예를 들어, 슬랙), 근육(예를 들어, 페네이션 각도, 사르코머 오버랩) 및 관절(예를 들어, 모멘트 암) 특성이 관절 각도에 의존하기 때문에 근육 길이-힘 관계와 직접적으로 동등하지 않다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 이를 위해, 계내 기능성 시험(48)에 있는 대형 동물은 생체내 시험이 말단 실험이라는 것을 명심하면서, 생체내 시험에 귀중한 추가가 될 수 있다. 실험 발견의 기계론적 통찰력을 향상시키기 위해 미래에 탐구될 수 있는 현재 프로토콜에 대한 다른 발전은 초음파 B 모드 이미징을 사용하여 근육 및 힘줄 구조적 특성을 측정하고, 자발적이고 전기적으로 자극된 수축 동안 근육력을 측정하기 위해 힘줄 힘 변환기를 이식하는 것을 포함한다(49).
방법의 중요성과 잠재적 인 적용
이 프로토콜은 돼지 등굴곡기 근육 그룹의 생체 내 토크 생성 능력을 평가하여 생리적 환경에서 근육 기능의 이득 또는 손실을 평가하는 비침습적 방법을 시연합니다. 상기 방법론은 돼지에게 비말단이기 때문에, 질병의 진행 동안, 또는 치료 전략의 전, 도중, 및 따르는 동안 종방향으로 동일한 피험자에서 근육 기능을 평가하는데 사용될 수도 있다. 따라서 반복적 인 측정 실험 설계는 독립적 인 측정에 비해 더 큰 힘과 더 적은 동물로 강력한 통계적 비교를 허용 할 수 있습니다. 추가적으로, 골격근 기능장애는 다양한 질환 과정 및 상태의 두드러진 성분, 예컨대 만성 질환-관련 근육 소모성 (예를 들어, 심부전, 신부전, AIDS, 암 등), 근이영양증, 신경퇴행성 질환 (예를 들어, SMA 또는 근위축성 측삭 경화증; ALS), 노화 (즉, 유육종증) 및 약물 독성. 골격근 기능 능력은 운동, 영양, 약물 및 재생 의학 요법과 같은 중재에 대한 중요한 주요 결과 척도입니다. 따라서, 생체내에서 돼지 토크 생성 능력을 신뢰성 있게 평가하기 위해 본원에 기재된 프로토콜은 수많은 연구 응용에 걸쳐 사용될 수 있다. 그것은 치료법 개발의 번역을 위해 광범위한 동물 데이터를 획득하는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
제시된 작업과 데이터는 BTC 및 SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR)에 대한 미 육군 의학 연구 및 재료 사령부에 의해 광범위하게 지원되었습니다. 재향 군인 업무부, 재향 군인 건강 관리국, 연구 개발 사무소 (I21 RX003188)와 JAC 및 Luke Brewster 박사. 저자들은 USAISR 수의학 서비스 및 비교 병리학 지부 및 UMN Advanced Preclinical Imaging Center가 이러한 연구를 완료하는 데 기술적 도움을 준 것에 대해 감사하게 생각합니다.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |