Den nåværende protokollen beskriver konsise eksperimentelle detaljer om evaluering og tolkning av in vivo dreiemoment data oppnådd via elektrisk stimulering av den vanlige peroneal nerve hos bedøvede griser.
Pålitelig vurdering av skjelettmuskulaturstyrke er uten tvil det viktigste resultatmålet i nevromuskulær og muskuloskeletale sykdoms- og skadestudier, spesielt når man vurderer regenerative terapiers effekt. I tillegg er et kritisk aspekt ved å oversette mange regenerative terapier demonstrasjonen av skalerbarhet og effektivitet i en stor dyremodell. Ulike fysiologiske preparater er etablert for å evaluere iboende muskelfunksjonsegenskaper i grunnleggende vitenskapsstudier, hovedsakelig i små dyremodeller. Praksisen kan kategoriseres som: in vitro (isolerte fibre, fiberbunter eller hele muskel), in situ (muskel med intakt vaskularisering og innervering, men distal sene festet til en krafttransduser), og in vivo (strukturer i muskel- eller muskelenheten forblir intakte). Det er styrker og svakheter ved hver av disse forberedelsene; En klar fordel med in vivo styrketesting er imidlertid evnen til å utføre gjentatte målinger i samme dyr. Heri presenteres materialene og metodene for pålitelig vurdering av isometrisk dreiemoment produsert av bakre dorsiflexormuskler in vivo som svar på standard peroneal elektrisk stimulering hos bedøvede griser.
Den primære funksjonen til skjelettmuskulatur er å produsere kraft, noe som til slutt gjør aktiviteter som å puste, spise og ambulere mulig. Forhold som reduserer skjelettmuskulatur funksjonell kapasitet kan føre til redusert ytelse (yrkesmessig eller sport), funksjonshemming eller død. For eksempel er vedlikehold av muskelmasse og funksjon i aldrende populasjoner positivt forbundet med livskvalitet og kapasitet til å utføre grunnleggende og instrumentelle aktiviteter i dagliglivet 1,2. Og fallende muskelstyrke hos Duchenne muskeldystrofipasienter resulterer i manglende evne til å ambulate og respiratorisk svikt, og til slutt bidra til for tidlig dødelighet 3,4,5. Dermed er muskelstyrkemåling et kritisk utfallsmål i studier som involverer nevromuskulær sykdom eller skade.
Maksimal frivillig isometrisk eller isokokinetisk dreiemoment (og/eller utmattelsesindeks) brukes ofte som en indeks over funksjonell kapasitet i kliniske studier6. I dyrestudier kan analoge målinger gjøres in vivo ved hjelp av elektrisk nervestimulering mens de er under anestesi. Spesielt er in vivopreparater minimalt invasive med muskulatur, sener, vaskulatur og innervasjon som forblir intakte og tillater derfor gjentatte funksjonelle vurderinger 7,8,9,10,11. Dette preparatet brukes ofte i små gnagermodeller og i mindre grad i større dyremodeller som kaniner12, hunder13,14, sau15 og griser16,17. Den generelle bruken av slik metodikk kan påvirke mange translasjonelle forskningsstudier, for eksempel i genmodifiserte porcine (gris) modeller av spinal muskelatrofi (SMA)18. Heri presenteres metoder for å vurdere nervestimulering-indusert maksimal isometrisk dreiemoment av porcin dorsiflexor muskelgruppen in vivo. Teknikkene som ble presentert ble opprinnelig tilpasset fra de som opprinnelig ble utviklet for å vurdere musens fremre crural muskelmoment19,20 og deretter raffinert gjennom erfaring med å undersøke dreiemomentproduserende kapasitet etter skade 17,21,22,23,24,25,26,27,28 og under utvikling16 i ulike svinemodeller.
Denne protokollen fremhever in vivo isometrisk dreiemomentmåling ved hjelp av metodikk som krever en datamaskin integrert med en veiecelle og elektrisk stimulator. Metodene som presenteres her, bruker et kommersielt tilgjengelig integrert svineisometrisk fotplatetestapparat, plattformapparat og tilsvarende programvare (se Materialliste). Metodikken kan imidlertid tilpasses for å bruke annen kommersielt tilgjengelig eller skreddersydd programvare, datainnsamlingsenheter og stimulatorer. Disse metodene er ment for bruk i en dedikert stor dyrekirurgisk suite fylt med standardutstyr som: låse kirurgisk bord, andre låsebord med lik høyde for testplattformen, respirator og overvåkingsenheter, og varmematte eller andre enheter for å opprettholde kroppstemperaturen.
Følgende teammedlemmer er nødvendige for å utføre disse metodene: en dyktig anestesitekniker og to studiepersonell for å utføre den funksjonelle testingen. Disse menneskene vil jobbe sammen for den første stabiliseringen av lemmen på plattformapparatet. Deretter vil en av de to personellene være ansvarlig for elektrodeplassering / posisjonering og den andre for dataapplikasjonene under testingen.
Kritiske trinn, endringer og feilsøking
For å minimere variasjon i data og maksimere tilnærmingens suksess, fremheves følgende kritiske trinn.
Optimal nervestimulering
Denne eksperimentelle tilnærmingen starter med nerve axon depolarisering og er avhengig av riktig elektrodeplassering og optimalisert elektrisk stimulering. En post-mortem analyse av nerveanatomi relatert til benete landemerker kan bidra til å visualisere riktig elektrodeplassering under testing. Å skaffe seg maksimalt rykninger dreiemoment bidrar til å bestemme passende strøm (i milliampere; mA) levert til nerve axon. Det er to verdier du må huske på når du optimaliserer nervestimulering ved testingens begynnelse: (1) det rykk-til-tetaniske forholdet er ~ 1:5, for eksempel ~ 2 N·m rykningsmoment tilsvarer et 10 N·m tetanisk dreiemoment (figur 3); og (2) det typiske dreiemomentet til kroppsmassen er ~ 0,3 N·m per kg kroppsmasse (figur 4). Hvis de høyeste rykninger dreiemomentene ser lave ut, fjern elektrodene og prøv en annen plassering. Kontroller stimulatorinnstillinger, BNC-tilkoblinger og elektrodetilkoblinger. Elektrodeplassering kan være nødvendig mellom sammentrekninger hvis det er for mye bevegelse under plassering av lemmen mellom leddvinkler, som nevnt ovenfor (figur 2). Vær oppmerksom på at eksperimentelle og intervensjonelle tilnærminger kan påvirke disse verdiene.
Riktig biomekanisk justering
Startmuskellengde påvirker muskelkontraktil kraft (lengdespenningsforholdet), og muskellengden kan endres basert på hofte-, kne- og ankelleddjustering. Leddvinklene må standardiseres mellom lemmer og blant griser. En 90° ankelleddvinkel anbefales sterkt for hofte og kne. En litt plantarflekset ankelposisjon (~30° fra den nøytrale 0° ankelleddvinkelen) er optimal for toppstyrke. Det gjenspeiler den naturlige anatomiske posisjonen til ankelleddet hos både griser og hunder mens du står. Alle ledd bør også være parallelle med fotpedal- og dreiemomenttransdusere for å unngå tap av målbart dreiemoment på grunn av bidraget fra en vinkelrett dreiemomentvektor. Inspeksjon av hofte-kne-ankelleddvinkler og fotpedalleddjustering anbefales på det sterkeste etter at foten er festet til fotpedalen og kneleddet festes med lemklemmestengene (figur 1). Hvis det er feiljustering, lås opp og fjern stolpene og omplasser grisen på det kirurgiske bordet. Selv om standardisering av felles vinkler på tvers av studier er avgjørende for å minimere datavariasjon, er det begrensninger for biomekanisk justering som er bemerkelsesverdige, diskutert nedenfor.
Betydning med hensyn til eksisterende eller alternative metoder
Alterative eksempler på klinisk relevante og ikke-invasive vurderinger av muskelfunksjon som kan brukes til svinemodeller inkluderer tredemølle gangavstand, EMG og aktiv muskelskjærbølge elektrografi. Som 6 min gange test hos mennesker, en tredemølle walking test kan evaluere sykdom progresjon og intervensjon suksess hos store dyr 33,34,35. Vanligvis, etter en akklimatiseringsperiode, går dyr til slutten av overholdelse ved forskjellige tredemøllehastigheter og / eller hellingsnivåer. Matbelønninger er ofte nødvendig for å oppnå maksimal motivasjon. Tredemølle walking outcomes tilbyr imidlertid bare indirekte tolkninger av muskelkontraktil funksjon på grunn av begrensninger som fagmotivasjon, ikke-maksimal motorenhetsrekruttering og iboende avhengighet av andre kroppssystemer som kardiovaskulære, skjelett- og åndedrettssystemer.
På den annen side tilbyr EMG en litt bedre direkte vurdering av skjelettmuskulatursystemet, da EMG-elektroder plasseres direkte på muskelgruppen av interesse 36,37,38. EMG-elektroder måler deretter den kollektive muskelaktiviteten (depolariserte muskelfibre). Denne muskelaktiviteten er basert på rekruttering av motorenheter og hastighetskoding (frekvensen av handlingspotensialer sendt til rekrutterte motorenheter). Det er imidlertid umulig å skille de relative bidragene til rekruttering av motorenheter kontra hastighetskoding med overflate-EMG. Videre er EMG avhengig av emnevilje for å generere maksimale sammentrekninger, og dette samarbeidsnivået er usannsynlig i store dyremodeller. Selv om det kan være informativt å vurdere endringer i EMG i gangsyklusen, representerer disse dataene ikke en maksimal funksjonell evne til skjelettmuskulaturgruppen av interesse. Ultralydbasert avbildning ved hjelp av B-modus og skjærbølgeelastografi er en annen ikke-invasiv modalitet som brukes til å evaluere muskelfunksjon. Det er en god sammenheng mellom Youngs modulus målt ved elastografi og økende muskelbelastningpå 39,40. Skjærbølge elastografi har blitt validert og brukt som et kvantitativt mål på passiv vev stivhet 41,42,43,44,45, inkludert i en porcine volumetrisk muskel tap skade modell 23. Det kan også brukes som en indirekte måling av aktiv muskelkraftproduksjon39. Imidlertid er begrensninger som ligner på EMG for fagvilje og samarbeid for å utføre sammentrekninger fortsatt til stede.
In vivo-protokollen som er beskrevet her, i motsetning til tredemølle gangavstand og EMG, gir en pålitelig, reproduserbar og maksimal vurdering av muskelfunksjon. Denne protokollen fremkaller muskelsammentrekninger på en kontrollert, kvantifiserbar måte som er uavhengig av motivasjon. Spesielt brukes perkutane elektroder til å stimulere nerveaksoner som omgår sentralnervesystemet. Depolarisering av nerveaksonene engasjerer alle motorenheter som eliminerer variasjon knyttet til rekruttering av motorenheter. I tillegg kontrollerer undersøkeren hastighetskoding (stimuleringsfrekvens). Den resulterende nevromuskulære fysiologien som gjelder for denne tilnærmingen starter med spenningsportert natriumkanalaktivering ved nodene i Ranvier. All etterfølgende (eller nedstrøms) fysiologi er engasjert, inkludert eksitasjons-sammentrekningskobling og kryssbrosykling. En betydelig fordel med in vivo ikke-invasiv muskelanalyse er at kontraktil muskelfunksjon kan måles gjentatte ganger, for eksempel ukentlig, for å overvåke muskelstyrke etter skade, intervensjon eller over en sykdomsprogresjon.
Begrensninger ved metoden
In vivo-utstyret som er beskrevet i denne protokollen tillater passivt og aktivt isometrisk dreiemoment som en funksjon av leddvinkel og stimuleringsfrekvens. Testapparatet som brukes støtter ikke måling av dynamiske sammentrekninger (f.eks. isokinetiske eksentriske eller konsentriske sammentrekninger). Apparatet gjør det mulig for et 105° bevegelsesområde å karakterisere dreiemoment-leddvinkelforholdet og bruker en veiecelle med et maksimalt dreiemomentområde på ~ 50 N·m. Spesifikke eksperimentelle spørsmål kan kreve ytelsesegenskaper utenfor disse spesifikasjonene. Spesielt kan veiecellen på dette beskrevne apparatet byttes ut med større dreiemomentområder om nødvendig.
Protokollen beskrevet heri for å måle maksimal nevromuskulær styrke in vivo har bemerkelsesverdige begrensninger. For det første krever denne metoden anestesi, som kan utføres annerledes per dyrefasilitetsprotokoller og ressurser. Bedøvelse er kjent for å ha varierende effekter på nevromuskulær funksjon og har vist seg å endre mus in vivo dorsiflexor dreiemoment produksjon i en bedøvelses- og -doseavhengig måte29. Differensialeffektene av bedøvelse på det store dyrets in vivo-dreiemoment er uklare; Derfor må kontroll- og eksperimentelle grupper ha de samme anestesimidlene (f.eks. alle grupper som administreres ketamin) for å kontrollere denne variasjonen. For det andre begrenser avhengighet av in vivo diffusjonsmønstre utforskning av cellulære mekanismer for kontraktil dysfunksjon og akutte narkotikatoksisiteter. For eksempel kan koffein brukes under in vitro organbadtesting av en isolert muskel for å stimulere sarkoplasmisk retikulum kalsiumfrigjøring, omgå eksitasjonskontraksjonskobling46 direkte. Mengden koffein for å indusere denne effekten (mM) er dødelig i en in vivo-setting . Legemiddelpåvirkninger på hele kroppen (f.eks. nyre/leverstress) og påfølgende faktorer utskilt i omløp må vurderes dersom denne tilnærmingen brukes til legemiddelscreening på akutt muskelstyrke23. For det tredje avviker bruken av maksimal elektrisk nervestimulering fra frivillige rekrutteringsstrategier, som diskutert ovenfor, og gjenspeiler derfor ikke endringer i styrke som kan skyldes nevromuskulære rekrutteringstilpasninger.
In vivo-dreiemomentmålinger kan også være begrenset med hensyn til å etablere en bestemt mekanisme for eksperimentelle observasjoner. For eksempel avhenger dreiemomentet om ankelleddet ikke bare av muskelkraftproduksjon, men også på sene- og ledd- og bindevevsegenskapene. Videre genereres kraft av grupper av muskler, spesielt plantarfleksorene (gastrocnemius, soleus og plantaris muskler) og dorsiflexors (peroneus tertius, tibialis og digitorum muskler) hos griser. Derfor krever tolkninger av maksimale in vivo-dreiemomentdata hensynet til potensielle muskullotendinøse og anatomiske endringer og er begrenset til muskelgrupper, ikke individuelle muskler. Relatert består muskelgrupper ofte av en blanding av overveiende raske og langsomme muskelfibre, som gastrocnemius og soleusmuskelen, henholdsvis av plantarfleksorene. Kontraktile egenskaper som sammentrekningshastighet og avslapning (eller tid-til-topp sammentrekning og halv-avslapningstid) er ikke pålitelige indikatorer på fibertype fysiologi ved hjelp av in vivo versus isolerte muskelpreparater, for eksempel in vitro eller in situ testing protokoller47. Isolerte muskelpreparater er også overlegen i å forstå påvirkningen av biomekaniske parametere på muskelfunksjon fordi egenskaper som muskellengde kan kontrolleres nøyaktig; Det er viktig å understreke at forholdet mellom leddvinkelmomentet ikke direkte tilsvarer forholdet mellom muskellengde og kraft, da sener (f.eks. slakk), muskler (f.eks. penneringsvinkel, sarkomeroverlapping) og leddegenskaper (f.eks. momentarm) som bidrar til dreiemomentproduksjon, er avhengige av leddvinkelen. For det formål kan stor dyr in situ funksjonell testing48 være et verdifullt tillegg til in vivo testing, med tanke på at in situ testing er et terminalt eksperiment. Andre fremskritt i den nåværende protokollen som kan utforskes i fremtiden for å forbedre den mekanistiske innsikten i eksperimentelle funn inkluderer bruk av ultralyd B-modus bildebehandling for å måle muskel- og senearkitekturegenskaper og implantasjon av en senekrafttransduser for å måle muskelkraft under frivillige og elektrisk stimulerte sammentrekninger49.
Viktigheten og potensielle anvendelser av metoden
Denne protokollen evaluerer in vivo dreiemomentproduserende kapasitet av porcin dorsiflexor muskelgruppen, demonstrerer en ikke-invasiv metode for å vurdere gevinst eller tap av muskelfunksjon i en fysiologisk setting. Fordi metodikken ikke er terminal for grisen, kan den også brukes til å evaluere muskelfunksjon hos de samme fagene langsgående under utviklingen av en sykdom, eller før, under og etter en behandlingsstrategi. Som sådan kan et gjentatt tiltak eksperimentell design muliggjøre robuste statistiske sammenligninger med større kraft og færre dyr sammenlignet med uavhengige tiltak. I tillegg er skjelettmuskulaturdysfunksjon en fremtredende komponent i ulike sykdomsprosesser og tilstander, for eksempel kronisk sykdomsrelatert muskelsvømt (f.eks. hjertesvikt, nyresvikt, AIDS, kreft, etc.), muskeldystrofi, nevrodegenerative sykdommer (f.eks. SMA eller amyotrofisk lateral sklerose; ALS), aldring (dvs. sarkopeni) og toksisiteter. Skjelettmuskelfunksjonell kapasitet er et kritisk primært utfallstiltak for intervensjoner som trening, ernæring og legemiddel- og regenerative medisinbehandlinger. Dermed kan protokollen beskrevet heri for pålitelig evaluering av porcinmomentproduserende kapasitet in vivo brukes på tvers av mange studieapplikasjoner. Det kan være medvirkende til å skaffe omfattende dyredata for oversettelse av utviklingsterapier.
The authors have nothing to disclose.
Arbeid og data som ble presentert ble støttet bredt av US Army Medical Research and Material Command til BTC og SMG (#MR140099; #C_003_2015_USAISR; #C_001_2018_USAISR); og Institutt for veteransaker, Veterans Health Administration, Office of Research and Development (I21 RX003188) til JAC og Dr. Luke Brewster. Forfatterne anerkjenner takknemlig USAISR Veterinary Service og Comparative Pathology Branchs og UMN Advanced Preclinical Imaging Center for teknisk assistanse i å fullføre disse studiene.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |