يصف هذا البروتوكول تفاصيل تجريبية موجزة عن تقييم وتفسير بيانات عزم الدوران في الجسم الحي التي تم الحصول عليها عن طريق التحفيز الكهربائي للعصب الشظوي المشترك في الخنازير المخدرة.
يمكن القول إن التقييم الموثوق به لقوة العضلات الهيكلية هو أهم مقياس للنتائج في دراسات الأمراض العصبية العضلية والعضلية الهيكلية والإصابات ، خاصة عند تقييم فعالية العلاجات التجديدية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد الجوانب الحاسمة لترجمة العديد من العلاجات التجديدية هو إظهار قابلية التوسع والفعالية في نموذج حيواني كبير. تم إنشاء العديد من الاستعدادات الفسيولوجية لتقييم خصائص وظيفة العضلات الجوهرية في الدراسات العلمية الأساسية ، في المقام الأول في النماذج الحيوانية الصغيرة. يمكن تصنيف الممارسات على النحو التالي: في المختبر (الألياف المعزولة أو حزم الألياف أو العضلات بأكملها) ، في الموقع (العضلات ذات الأوعية الدموية السليمة والتعصيب ولكن الوتر البعيد المرتبط بمحول القوة) ، وفي الجسم الحي (تظل هياكل العضلات أو وحدة العضلات سليمة). هناك نقاط قوة وضعف لكل من هذه التحضيرات. ومع ذلك ، فإن الميزة الواضحة لاختبار القوة في الجسم الحي هي القدرة على إجراء قياسات متكررة في نفس الحيوان. هنا ، يتم تقديم المواد والطرق اللازمة لتقييم عزم الدوران متساوي القياس الذي تنتجه عضلات الظهرية الخلفية في الجسم الحي استجابة للتحفيز الكهربائي الشظوي القياسي في الخنازير المخدرة.
تتمثل الوظيفة الأساسية للعضلات الهيكلية في إنتاج القوة ، مما يجعل في النهاية أنشطة مثل التنفس والأكل والإسعاف ممكنة. يمكن أن تؤدي الحالات التي تقلل من القدرة الوظيفية للعضلات الهيكلية إلى انخفاض الأداء (المهني أو الرياضي) أو الإعاقة أو الوفاة. على سبيل المثال ، يرتبط الحفاظ على كتلة العضلات ووظيفتها في السكان المسنين ارتباطا إيجابيا بنوعية الحياة والقدرة على أداء الأنشطة الأساسية والفعالة للحياة اليومية 1,2. ويؤدي انخفاض قوة العضلات لدى مرضى ضمور العضلات في دوشين إلى عدم القدرة على التجول وفشل الجهاز التنفسي ، مما يساهم في النهاية في الوفيات المبكرة3،4،5. وبالتالي ، فإن قياس قوة العضلات هو مقياس نتائج حرج في الدراسات التي تنطوي على مرض عصبي عضلي أو إصابة.
غالبا ما يستخدم عزم الدوران المتماثل أو الأيزوكيني الطوعي الأقصى (و / أو مؤشر التعب) كمؤشر للقدرة الوظيفية في الدراسات السريرية6. في الدراسات التي أجريت على الحيوانات ، يمكن إجراء قياسات مماثلة في الجسم الحي باستخدام تحفيز الأعصاب الكهربائية أثناء التخدير. والجدير بالذكر أن الاستعدادات في الجسم الحي طفيفة التوغل مع بقاء العضلات والأوتار والأوعية الدموية والتعصيب سليمة وبالتالي تسمح بإجراء تقييمات وظيفية متكررة7،8،9،10،11. يستخدم هذا المستحضر عادة في نماذج القوارض الصغيرة وإلى حد أقل في النماذج الحيوانية الكبيرة مثل الأرانب 12 والكلاب13,14 والأغنام 15 والخنازير16,17. يمكن أن يكون الاستخدام العام لهذه المنهجية مؤثرا على العديد من الدراسات البحثية الانتقالية ، كما هو الحال في نماذج الخنازير (الخنزير) المهندسة وراثيا لضمور العضلات الشوكي (SMA)18. هنا ، يتم تقديم طرق لتقييم عزم الدوران متساوي القياس الأقصى الناجم عن تحفيز الأعصاب لمجموعة العضلات الظهرية الخنازير في الجسم الحي. تم تكييف التقنيات المقدمة في البداية من تلك التي تم تطويرها في الأصل لتقييم عزم دوران عضلات الفأر الأمامية19,20 وتم تحسينها لاحقا من خلال تجربة التحقيق في القدرة الإنتاجية لعزم الدوران بعد الإصابة 17,21,22,23,24,25,26,27,28 وأثناء التطوير16 في نماذج مختلفة من الخنزير.
يسلط هذا البروتوكول الضوء على قياس عزم الدوران متساوي القياس في الجسم الحي باستخدام منهجية تتطلب جهاز كمبيوتر متكامل مع خلية تحميل ومحفز كهربائي. تستخدم الطرق المعروضة هنا جهاز اختبار لوحة قدم متكامل متكامل متاح تجاريا ، وجهاز منصة ، وبرامج مقابلة (انظر جدول المواد). ومع ذلك، يمكن تكييف المنهجية لاستخدام البرامج الأخرى المتاحة تجاريا أو حسب الطلب، وأجهزة الحصول على البيانات، وأجهزة التحفيز. هذه الطرق مخصصة للاستخدام في جناح جراحي كبير مخصص للحيوانات مليء بالمعدات القياسية مثل: طاولة جراحية مقفلة ، طاولة قفل ثانية متساوية الارتفاع لمنصة الاختبار ، جهاز تهوية وأجهزة مراقبة ، وحصيرة تدفئة أو أجهزة أخرى للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
هناك حاجة إلى أعضاء الفريق التالية أسماؤهم لإجراء هذه الأساليب: فني تخدير ماهر واحد واثنين من موظفي الدراسة لإجراء الاختبار الوظيفي. سيعمل هؤلاء الأشخاص معا من أجل التثبيت الأولي للطرف على جهاز المنصة. بعد ذلك ، سيكون أحد الشخصين مسؤولا عن وضع / تحديد موضع القطب والآخر عن تطبيقات الكمبيوتر أثناء الاختبار.
الخطوات الهامة والتعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لتقليل تباين البيانات إلى الحد الأدنى وزيادة نجاح النهج إلى أقصى حد ، يتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة التالية.
التحفيز الأمثل للأعصاب
يبدأ هذا النهج التجريبي بإزالة الاستقطاب العصبي ويعتمد على وضع القطب الكهربائي الصحيح والتحفيز الكهربائي الأمثل. يمكن أن يساعد تحليل تشريح الأعصاب المرتبط بالمعالم العظمية بعد الوفاة في تصور موضع القطب الكهربائي المناسب أثناء الاختبار. يساعد الحصول على أقصى عزم دوران للارتعاش على تحديد التيار المناسب (بالمللي أمبير ؛ mA) الذي يتم توصيله إلى المحور العصبي. هناك قيمتان يجب مراعاتهما عند تحسين تحفيز الأعصاب في بداية الاختبار: (1) نسبة الارتعاش إلى الكزاز هي ~ 1: 5 ، على سبيل المثال ، ~ 2 نيوتن متر عزم الدوران النشل يتوافق مع عزم دوران الكزاز 10 نيوتن متر (الشكل 3) ؛ و (2) عزم الدوران النموذجي لكتلة الجسم هو ~ 0.3 نيوتن متر لكل كجم كتلة الجسم (الشكل 4). إذا ظهرت ذروة عزم الدوران النشل منخفضة ، فقم بإزالة الأقطاب الكهربائية وحاول وضع آخر. تأكد من التحقق من إعدادات المحفز واتصالات BNC واتصالات القطب الكهربائي. قد تكون هناك حاجة إلى إعادة وضع القطب الكهربائي بين الانقباضات إذا كان هناك الكثير من الحركة أثناء وضع الطرف بين زوايا المفصل ، كما هو مذكور أعلاه (الشكل 2). يرجى ملاحظة أن النهج التجريبية والتداخلية يمكن أن تؤثر على هذه القيم.
المحاذاة الميكانيكية الحيوية المناسبة
يؤثر بدء طول العضلات على قوة انقباض العضلات (علاقة الطول والتوتر) ، ويمكن أن يتغير طول العضلات بناء على محاذاة مفصل الورك والركبة والكاحل. يجب توحيد زوايا المفصل بين الأطراف وبين الخنازير. يوصى بشدة بزاوية مفصل الكاحل 90 درجة للورك والركبة. يعد وضع الكاحل المثني قليلا (~ 30 درجة من زاوية مفصل الكاحل المحايدة 0 درجة) مثاليا لقوة الذروة. وهو يعكس الوضع التشريحي الطبيعي لمفصل الكاحل في كل من الخنازير والكلاب أثناء الوقوف. يجب أن تكون جميع المفاصل موازية أيضا لدواسة القدم ومحولات عزم الدوران لتجنب فقدان عزم الدوران القابل للقياس بسبب مساهمة متجه عزم الدوران العمودي. يوصى بشدة بفحص زوايا مفصل الورك والركبة والكاحل ومحاذاة مفصل القدم ودواسة القدم بعد تثبيت القدم على دواسة القدم وتأمين مفصل الركبة بقضبان تثبيت الأطراف (الشكل 1). إذا كان هناك اختلال في المحاذاة ، فقم بفتح القضبان وإزالتها وإعادة وضع الخنزير على الطاولة الجراحية. في حين أن توحيد الزوايا المشتركة عبر الدراسات أمر بالغ الأهمية لتقليل تباين البيانات ، إلا أن هناك قيودا على المحاذاة الميكانيكية الحيوية جديرة بالملاحظة ، والتي نوقشت أدناه.
الأهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة أو البديلة
تشمل الأمثلة البديلة للتقييمات ذات الصلة سريريا وغير الغازية لوظيفة العضلات التي يمكن استخدامها لنماذج الخنازير مسافة المشي على جهاز المشي ، وتخطيط كهربية العضل ، والتصوير الكهربائي لموجة قص العضلات النشطة. كاختبار المشي لمدة 6 دقائق في البشر ، يمكن لاختبار المشي على جهاز المشي تقييم تطور المرض ونجاح التدخل في الحيوانات الكبيرة33،34،35. عادة ، بعد فترة التأقلم ، يتم المشي على الحيوانات حتى نهاية الامتثال بسرعات مختلفة من جهاز المشي و / أو مستويات الانحدار. غالبا ما تكون المكافآت الغذائية ضرورية لتحقيق أقصى قدر من التحفيز. ومع ذلك ، فإن نتائج المشي على جهاز المشي لا تقدم سوى تفسيرات غير مباشرة لوظيفة انقباض العضلات بسبب القيود مثل الدافع الموضوعي ، وتوظيف الوحدة الحركية غير القصوى ، والاعتماد المشترك المتأصل على أنظمة الجسم الأخرى مثل القلب والأوعية الدموية والهيكل العظمي والجهاز التنفسي.
من ناحية أخرى ، يقدم EMG تقييما مباشرا أفضل قليلا لنظام العضلات الهيكلية ، حيث يتم وضع أقطاب EMG مباشرة على مجموعة العضلات ذات الاهتمام36،37،38. ثم تقيس أقطاب EMG نشاط العضلات الجماعي (ألياف العضلات غير المستقطبة). يعتمد هذا النشاط العضلي على توظيف الوحدة الحركية وترميز المعدل (تواتر إمكانات العمل المرسلة إلى الوحدات الحركية المعينة). ومع ذلك ، فإن فصل المساهمات النسبية لتوظيف الوحدات الحركية مقابل ترميز المعدل أمر مستحيل مع EMG السطحي. علاوة على ذلك ، يعتمد EMG على استعداد الموضوع لتوليد أقصى قدر من الانقباضات ، وهذا المستوى من التعاون غير مرجح في النماذج الحيوانية الكبيرة. في حين أنه قد يكون من المفيد تقييم التغيرات في EMG خلال دورة المشي ، فإن هذه البيانات لا تمثل قدرة وظيفية قصوى لمجموعة العضلات الهيكلية المثيرة للاهتمام. التصوير القائم على الموجات فوق الصوتية باستخدام الوضع B والتصوير المطاطي لموجة القص هو طريقة أخرى غير جراحية تستخدم لتقييم وظيفة العضلات. هناك علاقة جيدة بين معامل يونغ الذي تم قياسه بواسطة التصوير المطاطي وزيادة أحمال العضلات39,40. تم التحقق من صحة التصوير المطاطي لموجة القص واستخدامه كمقياس كمي لتصلب الأنسجة السلبية41،42،43،44،45 ، بما في ذلك في نموذج إصابة فقدان العضلات الحجميالخنازير 23. ويمكن أيضا أن تستخدم كقياس غير مباشر لإنتاج قوة العضلات النشطة39. ومع ذلك ، لا تزال هناك قيود تشبه EMG لاستعداد الموضوع والتعاون في أداء الانقباضات.
يوفر بروتوكول في الجسم الحي الموصوف هنا ، على النقيض من مسافة المشي على جهاز المشي و EMG ، تقييما موثوقا به وقابلا للتكرار وأقصى قدر من وظيفة العضلات. يستحضر هذا البروتوكول تقلصات العضلات بطريقة خاضعة للرقابة وقابلة للقياس الكمي ومستقلة عن الدافع. على وجه التحديد ، يتم استخدام الأقطاب الكهربائية عن طريق الجلد لتحفيز محاور الأعصاب التي تتجاوز الجهاز العصبي المركزي. يؤدي إزالة الاستقطاب من المحاور العصبية إلى إشراك جميع الوحدات الحركية مما يلغي التباين المرتبط بتوظيف الوحدات الحركية. بالإضافة إلى ذلك ، يتحكم المحقق في ترميز المعدل (تردد التحفيز). يبدأ علم وظائف الأعضاء العصبية العضلية الناتج الذي ينطبق على هذا النهج بتنشيط قناة الصوديوم ذات بوابات الجهد في عقد رانفييه. يتم إشراك جميع الفسيولوجيا اللاحقة (أو في اتجاه المصب) ، بما في ذلك اقتران الإثارة والانكماش وركوب الدراجات عبر الجسور. ميزة كبيرة لتحليل العضلات غير الغازية في الجسم الحي هي أنه يمكن قياس وظيفة العضلات المقلصة بشكل متكرر ، على سبيل المثال ، أسبوعيا ، لمراقبة قوة العضلات بعد الإصابة أو التدخل أو تطور المرض.
قيود الطريقة
تسمح المعدات الموجودة في الجسم الحي الموصوفة في هذا البروتوكول بعزم الدوران متساوي القياس السلبي والنشط كدالة لزاوية المفصل وتردد التحفيز. لا يدعم جهاز الاختبار المستخدم قياس الانقباضات الديناميكية (على سبيل المثال ، الانقباضات الغريبة الأطوار أو متحدة المركز). يسمح الجهاز بنطاق حركة 105 درجة لتوصيف علاقة زاوية عزم الدوران والمفصل ويستخدم خلية تحميل بنطاق عزم دوران أقصى يبلغ ~ 50 نيوتن متر. قد تتطلب أسئلة تجريبية محددة خصائص أداء خارج هذه المواصفات. ومن الجدير بالذكر أنه يمكن استبدال خلية التحميل الموجودة على هذا الجهاز الموصوف بنطاقات عزم دوران أكبر إذا لزم الأمر.
البروتوكول الموصوف هنا لقياس القوة العصبية العضلية القصوى في الجسم الحي له قيود ملحوظة. أولا ، تتطلب هذه الطريقة التخدير ، والذي يمكن إجراؤه بشكل مختلف وفقا لبروتوكولات وموارد المرافق الحيوانية. من المعروف أن التخدير له تأثيرات متفاوتة على الوظيفة العصبية العضلية وقد ثبت أنه يغير الفأر في إنتاج عزم الدوران الظهري في الجسم الحي بطريقة مخدرة وتعتمد على الجرعة29. الآثار التفاضلية للتخدير على الحيوان الكبير في عزم الدوران الحي غير واضحة. لذلك ، يجب أن يكون لدى المجموعات الضابطة والتجريبية نفس عوامل التخدير (على سبيل المثال ، جميع المجموعات التي تدار الكيتامين) للتحكم في هذا التباين. ثانيا، يحد الاعتماد على أنماط الانتشار في الجسم الحي من استكشاف الآليات الخلوية للخلل الوظيفي الانقباضي والسمية الحادة للأدوية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الكافيين أثناء اختبار حمام العضو في المختبر لعضلة معزولة لتحفيز إطلاق الكالسيوم الشبكي الساركوبلازمي ، متجاوزا اقتران الإثارة والانكماش46 مباشرة. كمية الكافيين للحث على هذا التأثير (mM) قاتلة في بيئة في الجسم الحي . يجب النظر في تأثيرات المخدرات على الجسم كله (على سبيل المثال ، إجهاد الكلى / الكبد) والعوامل اللاحقة التي تفرز في الدورة الدموية إذا تم استخدام هذا النهج لفحص المخدرات على قوة العضلات الحادة23. ثالثا ، ينحرف استخدام التحفيز الأقصى للعصب الكهربائي عن استراتيجيات التوظيف الطوعي ، كما نوقش أعلاه ، وبالتالي لا يعكس التغيرات في القوة التي قد تكون ناتجة عن تكيفات التوظيف العصبي العضلي.
وقد تكون قياسات عزم الدوران في الجسم الحي محدودة أيضا فيما يتعلق بإنشاء آلية محددة للملاحظات التجريبية. على سبيل المثال ، لا يعتمد عزم الدوران حول مفصل الكاحل على إنتاج قوة العضلات فحسب ، بل يعتمد أيضا على خصائص الأوتار والمفاصل والنسيج الضام. علاوة على ذلك ، يتم توليد القوة بواسطة مجموعات من العضلات ، وتحديدا المثنيات الأخمصية (عضلات gastrocnemius و solus و plantaris) و dorsiflexors (peroneus tertius و tibialis و digitorum muscles) في الخنازير. لذلك ، تتطلب تفسيرات بيانات عزم الدوران الأقصى في الجسم الحي النظر في التغيرات العضلية والتشريحية المحتملة وتقتصر على مجموعات العضلات ، وليس العضلات الفردية. وفي سياق متصل، غالبا ما تتكون مجموعات العضلات من مزيج من الألياف العضلية السريعة والبطيئة في الغالب، مثل العضلة المعدية والعضلات الوحيدة، على التوالي، من الثنيات الأخمصية. خصائص الانقباض مثل معدل الانقباض والاسترخاء (أو الانقباض من الوقت إلى الذروة ووقت نصف الاسترخاء) ليست مؤشرات موثوقة لفسيولوجيا نوع الألياف المستخدمة في الجسم الحي مقابل مستحضرات العضلات المعزولة ، مثل بروتوكولات الاختبار في المختبر أو في الموقع 47. الاستعدادات العضلية المعزولة متفوقة أيضا في فهم تأثير المعلمات الميكانيكية الحيوية على وظيفة العضلات لأنه يمكن التحكم بدقة في خصائص مثل طول العضلات. من المهم التأكيد على أن العلاقة بين زاوية المفصل وعزم الدوران ليست مكافئة مباشرة للعلاقة بين طول العضلات وقوتها ، حيث أن خصائص الأوتار (على سبيل المثال ، الركود) ، والعضلات (على سبيل المثال ، زاوية القلم ، تداخل الساركومير) ، والمفصل (على سبيل المثال ، ذراع اللحظة) التي تساهم في إنتاج عزم الدوران تعتمد على زاوية المفصل. وتحقيقا لهذه الغاية ، يمكن أن يكون الاختبار الوظيفي للحيوانات الكبيرة في الموقع48 إضافة قيمة إلى الاختبار في الجسم الحي ، مع الأخذ في الاعتبار أن الاختبار في الموقع هو تجربة نهائية. وتشمل التطورات الأخرى في البروتوكول الحالي التي يمكن استكشافها في المستقبل لتحسين الرؤية الميكانيكية للنتائج التجريبية استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية B-mode لقياس الخصائص المعمارية للعضلات والأوتار وزرع محول قوة الأوتار لقياس قوة العضلات أثناء الانقباضات الطوعية والمحفزة كهربائيا49.
أهمية والتطبيقات المحتملة للطريقة
يقيم هذا البروتوكول في الجسم الحي القدرة على إنتاج عزم الدوران لمجموعة العضلات الظهرية الخنازير ، مما يدل على طريقة غير جراحية لتقييم اكتساب أو فقدان وظيفة العضلات في بيئة فسيولوجية. نظرا لأن المنهجية ليست نهائية للخنزير ، يمكن استخدامها أيضا لتقييم وظيفة العضلات في نفس الموضوعات طوليا أثناء تطور المرض ، أو قبل وأثناء واتباع استراتيجية العلاج. على هذا النحو ، قد يسمح التصميم التجريبي للمقاييس المتكررة بإجراء مقارنات إحصائية قوية مع قوة أكبر وعدد أقل من الحيوانات مقارنة بالمقاييس المستقلة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد خلل العضلات الهيكلية مكونا بارزا في مختلف عمليات وحالات المرض ، مثل هزال العضلات المرتبط بالأمراض المزمنة (على سبيل المثال ، فشل القلب ، الفشل الكلوي ، الإيدز ، السرطان ، إلخ) ، ضمور العضلات ، الأمراض العصبية التنكسية (على سبيل المثال ، SMA أو التصلب الجانبي الضموري. ALS) ، والشيخوخة (أي ساركوبينيا) ، وسمية المخدرات. تعد القدرة الوظيفية للعضلات الهيكلية مقياسا حاسما للنتائج الأولية للتدخلات مثل التمارين الرياضية والتغذية والعلاجات الدوائية والتجديدية. وبالتالي ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لتقييم قدرة إنتاج عزم دوران الخنزير في الجسم الحي بشكل موثوق عبر العديد من تطبيقات الدراسة. قد يكون مفيدا في الحصول على بيانات حيوانية واسعة النطاق لترجمة العلاجات النامية.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم العمل والبيانات المقدمة على نطاق واسع من قبل قيادة البحوث الطبية والمواد في الجيش الأمريكي إلى BTC و SMG (#MR140099 ؛ #C_003_2015_USAISR ؛ #C_001_2018_USAISR) ؛ وإدارة شؤون المحاربين القدامى ، إدارة صحة المحاربين القدامى ، مكتب البحث والتطوير (I21 RX003188) إلى JAC والدكتور لوك بروستر. يعترف المؤلفون بامتنان بفروع الخدمة البيطرية وعلم الأمراض المقارن في USAISR ومركز التصوير قبل السريري المتقدم UMN للمساعدة الفنية في إكمال هذه الدراسات.
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite | Aurora Scientific Inc. | 615A | Compatible Win Vista/7/10 |
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus | Aurora Scientific Inc. | 892A | Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners |
Calibration Weights | Ohaus or similar | 80850116 | |
Computer | Aurora Scientific or any vendor | 601A | Computer must include data acquisition card and interface for software |
Gauze pad | Various vendors | 4 by 4 squares or similar | |
Monopolar Needle Electrodes | Chalgren, Electrode Store, or similar vendor | 242-550-24TP, or DTM-2.00SAF | |
Non-adhesive Flexiable Tape | 3M, Coflex, or similar | 4 inch by 5 yard role | |
Stimulator | Aurora Scientific or comparable | 701C | Must include constant current stimulation mode |