여기에서는 멜라노사이트를위한 최적화 된 직접 재 프로그래밍 시스템과 원활한 직접 재 프로그래밍을 보장하는 고효율, 집중 바이러스 포장 시스템에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
멜라닌 세포의 기능 상실은 vitiligo로 이어지며, 이는 영향을받는 개인의 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미칩니다. 현재, vitiligo에 대한 효과적인 장기 치료는 없습니다. 따라서 vitiligo에 대한 편리하고 효과적인 치료법을 개발하는 것이 필수적입니다. 피부 세포를 멜라닌 세포로 직접 재 프로그래밍하기위한 재생 의학 기술은 vitiligo의 유망한 새로운 치료법 인 것 같습니다. 이것은 환자의 피부 세포를 기능적 멜라닌 세포로 직접 재 프로그래밍하여 vitiligo 환자의 멜라닌 세포 손실을 개선하는 데 도움을줍니다. 그러나이 방법은 먼저 마우스에서 테스트해야합니다. 직접 재 프로그래밍이 널리 사용되지만, 멜라닌 세포로의 직접 재 프로그래밍을위한 명확한 프로토콜은 없습니다. 더욱이, 이용가능한 전사 인자의 수는 압도적이다.
여기서, 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템 프로토콜은 Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 및 Snai2를 포함하는 멜라닌 세포에 피부 세포를 재프로그래밍하기 위해 선택된 전사 인자를 생산하기 위해 제시된다. 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 시험관내에서 유도된 멜라노사이트(iMels)로의 MEFs의 직접적인 리프로그래밍을 위한 이들 모든 전사 인자에 대해 농축된 렌티바이러스로 감염시켰다. 또한, 이들 전사 인자를 스크리닝하고, 시스템은 멜라닌 세포에 대한 직접 재프로그래밍을 위해 최적화되었다. 유전자 또는 단백질 수준에서 iMels에서 멜라닌의 특징적인 마커의 발현이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 섬유아세포를 멜라노사이트로의 직접 재프로그래밍이 vitiligo에 대한 성공적인 새로운 치료 전략이 될 수 있고 멜라노사이트 발달 메커니즘을 확인할 수 있음을 시사하며, 이는 섬유아세포를 생체내에서 멜라노사이트로의 추가적인 직접적인 재프로그래밍을 위한 기초를 제공할 것이다.
서론
Vitiligo는 영향을받는 개인의 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미치는 피부 질환입니다. 대사 이상, 산화 스트레스, 염증 매개체의 생성, 세포 분리 및자가 면역 반응을 포함한 다양한 이유로 기능적 멜라닌 세포가 손실되고 멜라닌 분비가 중단되어 vitiligo 1,2의 발달로 이어집니다. 이 상태는 널리 발생하며 특히 얼굴에 문제가됩니다. 주요 치료는 코르티코 스테로이드 및 면역 조절제의 전신 사용입니다. 광선 요법은 전신 또는 국소 질환에 사용될 수 있으며, 천공 된 피부 이식 및 자가 멜라닌 세포 이식 3,4,5와 같은 외과 적 치료가 있습니다. 그러나 약물 요법과 광선 요법을 사용하는 환자는 재발하기 쉽고 이러한 치료법은 장기적인 치료 효과가 떨어집니다. 외과 적 치료는 외상성이며 적당히 효과적입니다 2,6. 따라서 vitiligo를 위해서는 새롭고 효과적인 치료 전략이 필요합니다.
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프로토콜
이 작업은 강소 대학 (UJS-IACUC-AP--20190305010)의 실험실 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 실험은 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC International)에 의해 설립 된 표준을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 인간과 관련된 실험은 없었기 때문에이 작업은 인간 연구 윤리위원회의 승인이 필요하지 않았습니다. 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 전사인자를 위한 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템 구축
- 농축된 바이러스의 생산(도 1A, B)
- 플레이트 1.5 × 106 HEK-293T 세포를 60 mm 디쉬에 넣고 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습 배양기에서 37°C에서 정상 배지(표 1 참조)로 배양하였다.
참고: 바이러스를 일괄적으로 포장해야 하는 경우 100mm 세포 배양 접시를 사용할 수 있습니다(자세한 내용은 표 2 참조). - 24시간 후, HEK-293T 세포가 형질도입 당일에 80-90% ....
- 플레이트 1.5 × 106 HEK-293T 세포를 60 mm 디쉬에 넣고 이들 세포를 5%CO2가 있는 가습 배양기에서 37°C에서 정상 배지(표 1 참조)로 배양하였다.
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결과
이 문서에는 섬유아세포를 멜라노세포로 직접 재프로그래밍하기 위한 전사 인자의 렌티바이러스를 생산하기 위한 농축된 렌티바이러스 패키징 시스템의 프로토콜과 MEF로부터 멜라닌 세포의 전사 인자 스크리닝 및 직접 리프로그래밍을 위한 프로토콜이 포함되어 있다.
농축된 렌티바이러스 생산의 성공은 GFP의 형광 강도를 관찰(도 1A) 또는 HEK-293T 세포를 비농축 렌티바이러스(1x) 및 농축 렌티바이러스(100x)로 48시간 동안 감염시킨 후 유세포 분석기(도 1B)에 의해 평가하였다. 농축된 바이러스의 역가는 10,8 TU/mL 이상이었으며, 이는 비교적 높다(도 1C).
멜라노사이트로의 섬유아세포의 직접 리프로그래밍은 전사 인자 렌.......
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토론
바이러스의 품질은이 프로토콜에서 멜라닌 세포에 대한 직접 재 프로그래밍의 성공에 중요합니다. 이 프로토콜에서 바이러스를 포장하고 농축하는 방법은 간단하고 반복하기 쉬우며 다른 보조 농축 시약에 의존하지 않습니다. 이 프로토콜은 대부분의 실험실에서 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 농축 된 바이러스의 품질을 보장하기 위해 다음 사항은 특별한주의가 필요합니다. 하나는 HEK-293T의 세포 상태입니다. HEK-293T 세포는 불멸화 된 세포이지만, 농축 된 바이러스를 만드는 데 사용되는 세포는 10 계대 이내에 건강한 세포이어야합니다 (역가는 더 높은 계대에 따라 감소합니다).
또 다른 중요한 점은 사용 된 형질 감염 시약 (이 경우 리포펙타민)의 비율입니다. 형질감염 시약을 첨가한 후 세포가 손상되기 때문에, 세포의 최적 상태와 바이러스의 품질을 보장하기 위해 플라스미드에 대한 시약의 비율을 반복적으로 점검해야 한다. 플라스미드에 대한 트랜스펙션 시약의 2:1 비율은 이 시스템에서.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82070638 및 81770621)과 장쑤성 자연 과학 재단 (BK20180281)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-062 | -20 °에 저장했습니다. C |
| 0.45 & M 필터 | Millipore | SLHVR33RB | |
| 5 mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브 | Falcon | 352052 | |
| 95%/100% 에탄올 | LANBAO | 210106 | RT |
| Adenine | Sigma | A2786 | 재고 농도 40 mg/mL 최종 농도 24 µ g/mL |
| Alexa Fluor 555 염소 안티 마우스 IgG2a | Invitrogen | A21137 | 사용하기 위한 1:500 희석 |
| Gibco | 15140-122 | -20 °에 저장; C | |
| Anti-TRP1/TYRP1 항체 | Millipore | MABC592 | Host/Isotype: Mouse IgG2a 종 반응성: Mouse/Human |
| Anti-TRP2/DCT 항체 | Abcam ab74073 | ab74073 | Host/Isotype: Rabbit IgG Species reactive: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Stock concentration 10 mM Final 농도 3 Μ M |
| 콜레라 독소 | Sigma | C8052 | 재고 농도 0.3 mg/mL 최종 농도 20 pM |
| Cy3 염소 항 토끼 IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 111-165-144 | 사용하기 위해 1:500의 희석 |
| C | |||
| DMSO | RT | ||
| FBS | Gibco | 10270-106 | -20 ° C 사용 전 열 비활성화 |
| 젤라틴 | 시그마 | G9391 | RT |
| GFP-PURO 플라스미드(Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 및 Snai2) | Hanheng Biological Technology Co., Ltd. | pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325 | -20°C에 저장됨; C |
| Hematoxylin | Abcam | ab220365 | RT |
| Human EDN3 | American-Peptide | 88-5-10A | 농도 100 μ M 최종 농도 0.1 μ M |
| 하이드로코르티손 | 시그마 | H0888 | 재고 농도 100 &마이크로; g/mL 최종 농도 0.5 & 마이크로; g/mL |
| L-DOPA | Sigma | D9628 | RT |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | 형질주입 시약, 4°C에 저장; C |
| Masson-Fontana 염색 키트 | Solarbio | G2032 | 4°C에 보관; C |
| 중성 발삼 | Solarbio | G8590 | 4 °에 저장; C |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | P6148 | RT |
| PBS (-) | Gibco | C10010500BT | RT |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA) | Sigma | P8139 | 농도 1 mM 최종 농도 200 nM |
| 폴리브레네 | 시그마 | H9268 | 양이온성 고분자 형질주입 시약; 재고 농도 8 μ g/&마이크로; L 최종 농도 4 ng/µ L |
| Puromycin | Gibco | A11138-03 | -20 °에 저장; C |
| 재조합 인간 bFGF | Invitrogen | 13256-029 | 재고 농도 4 μ g/mL 최종 농도 10 ng/mL |
| 재조합 인간 인슐린 | Sigma | I3536 | 재고 농도 10 mg/mL 최종 농도 5 &마이크로; g/mL |
| 재조합 인간 SCF | R& D | 255-SC-010 | 재고 농도 200 μ g/mL 최종 농도 100ng/mL |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | 4°C에 보관; C |
| 크실렌 | 시그마 | 1330-20-7 | RT에 저장 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
