Sviluppo di un modello di co-coltura cellulare per imitare l'ischemia/riperfusione cardiaca in vitro

Summary

La distanza spaziale è un parametro chiave nella valutazione del danno da ipossia/riossigenazione in un modello di co-coltura di strati cellulari endoteliali e cardiomiociti separati, suggerendo, per la prima volta, che l’ottimizzazione dell’ambiente spaziale di co-coltura è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti.

Abstract

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo. La riperfusione provoca ulteriori lesioni oltre l’ischemia. Le cellule endoteliali (CE) possono proteggere i cardiomiociti (CM) dalle lesioni da riperfusione attraverso le interazioni cellula-cellula. Le co-colture possono aiutare a studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula. Una co-coltura mista è l’approccio più semplice, ma è limitata in quanto i trattamenti isolati e le analisi a valle di singoli tipi di cellule non sono fattibili. Per indagare se le CE possono attenuare in modo dose-dipendente il danno alle cellule CM e se questa protezione può essere ulteriormente ottimizzata variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari, abbiamo utilizzato le cellule endoteliali dell’arteria coronaria primaria del topo e i cardiomiociti del topo adulto per testare tre tipi di inserti di coltura cellulare che variavano nella loro distanza dello strato intercellulare a 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. Solo nelle CM, il danno cellulare valutato dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) è aumentato significativamente durante l’ipossia e ulteriormente dopo la riossigenazione quando la distanza era di 2,0 mm rispetto a 0,5 e 1,0 mm. Quando le EC e le CM erano in contatto quasi diretto (0,5 mm), c’era solo una lieve attenuazione del danno da riossigenazione delle CM a seguito di ipossia. Questa attenuazione è stata significativamente aumentata quando la distanza spaziale era di 1,0 mm. Con una distanza di 2,0 mm, le CE hanno attenuato la lesione della CM sia durante l’ipossia che durante l’ipossia / riossigenazione, indicando che è necessario un sufficiente distanziamento di coltura per le CE per incrociare la diafonia con le CM, in modo che le molecole segnale secrete possano circolare e stimolare completamente le vie protettive. I nostri risultati suggeriscono, per la prima volta, che l’ottimizzazione dell’ambiente spaziale di co-coltura EC/CM è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo degli EC nella protezione CM contro le lesioni da ischemia/riperfusione simulate. L’obiettivo di questo rapporto è quello di fornire un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

Introduction

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo ^1,2. Tuttavia, il processo di trattamento della riperfusione può causare la morte dei cardiomiociti, nota come lesione da ischemia / riperfusione miocardica (IR), per la quale non esiste ancora un rimedio efficace³. Le cellule endoteliali (CE) sono state suggerite per proteggere i cardiomiociti (CM) attraverso la secrezione di segnali paracrini, nonché le interazioni cellula-cellula⁴.

I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula autocrine e/o paracrine sulla funzione e la differenziazione cellulare. Tra i modelli di co-coltura, la co-coltura mista è la più semplice, in cui due diversi tipi di cellule sono in contatto diretto all’interno di un singolo compartimento di coltura con un rapporto cellulare desiderato⁵. Tuttavia, trattamenti separati tra tipi di cellule e analisi a valle di un singolo tipo di cellula non sono prontamente fattibili data la popolazione mista.

Studi precedenti hanno indicato che gli insulti ipossici e ischemici causano danni significativi all’integrità della membrana cellulare misurata dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH). Questa lesione è peggiorata con la riossigenazione, imitando la lesione da riperfusione ^6,7,8. L’obiettivo dell’attuale protocollo era quello di testare le ipotesi che la presenza di EC possa attenuare in modo dose-dipendente la perdita di CM della membrana cellulare causata da ipossia e riossigenazione (HR) e che l’effetto protettivo degli EC possa essere ottimizzato variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari. Pertanto, abbiamo impiegato tre tipi di inserti di coltura cellulare e cellule endoteliali coronariche primarie di topo e cardiomiociti di topo adulti. Gli inserti, marchiati da Corning, Merck Millipore e Greiner Bio-One, ci hanno permesso di creare tre diverse condizioni di diafonia della coltura cellulare con distanze intercellulari di 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. 100.000 CE sono stati placcati per inserto in ciascun caso.

Inoltre, al fine di determinare se la densità delle CE in cocoltura contribuisca all’attenuazione del danno hr in questo modello, abbiamo studiato la relazione dose-risposta tra concentrazione CE e rilascio di LDH da parte dei CM. Le CE sono state placcate rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 per inserto, nell’inserto da 2,0 mm.

Questo rapporto fornisce un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

Protocol

1. Preparazione/placcatura sperimentale Mantenere CM ed EC secondo le istruzioni del produttore. Scongelare entrambe le linee cellulari quando arrivano dai fornitori. Piastra in palloni T25 dopo essere stata lavata con mezzi freschi. Si consiglia di acquistare ogni terreno di coltura cellulare dagli stessi fornitori da cui sono state acquistate le cellule. Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando sono confluenti. Mantenere l’incubatore di …

Representative Results

Tutti e tre i tipi di inserti (A, B, C) utilizzati in questo esperimento hanno la stessa dimensione dei pori di 0,4 μm. L’unica differenza tra loro è l’altezza da inserto a base, che consente alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere rispettivamente di 0,5, 1,0 e 2,0 mm (Figura 3) e che provengono da fornitori diversi (per i dettagli vedere Tabella dei materiali). Per stabilire un modello di co-coltura in vitro con…

Discussion

Passaggi critici nel protocollo
Modelli di co-coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare i meccanismi cellulari di cardioprotezione. Come creare due strati separati con una distanza significativa tra loro è, quindi, cruciale per lo sviluppo di un modello di co-cultura adatto. Una sfida nello studio della lesione IR simulata, cioè HR, è che non solo l’ischemia (ipossia) stessa, ma anche la riperfusione (reossigenazione) aggrava la disfunzione cellulare. Pertanto, un modello realistico deve…

Materials

Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested