Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Summary

La distance spatiale est un paramètre clé dans l’évaluation des lésions d’hypoxie / réoxygénation dans un modèle de co-culture de couches cellulaires endothéliales et cardiomyocytaires séparées, suggérant, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes.

Abstract

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde. La reperfusion provoque des blessures supplémentaires au-delà de l’ischémie. Les cellules endothéliales (CE) peuvent protéger les cardiomyocytes (CM) contre les lésions de reperfusion par le biais d’interactions cellule-cellule. Les co-cultures peuvent aider à étudier le rôle des interactions cellule-cellule. Une co-culture mixte est l’approche la plus simple, mais elle est limitée car les traitements isolés et les analyses en aval de types de cellules uniques ne sont pas réalisables. Pour déterminer si les CE peuvent atténuer les dommages aux cellules CM en fonction de la dose et si cette protection peut être encore optimisée en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires, nous avons utilisé des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes pour tester trois types d’inserts de culture cellulaire qui variaient dans leur distance de couche intercellulaire à 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. Dans les CM seulement, les lésions cellulaires évaluées par la libération de lactate déshydrogénase (LDH) ont augmenté de manière significative pendant l’hypoxie et plus loin lors de la réoxygénation lorsque la distance était de 2,0 mm par rapport à 0,5 et 1,0 mm. Lorsque les EC et les CM étaient en contact presque direct (0,5 mm), il n’y avait qu’une légère atténuation de la lésion de réoxygénation des CM après une hypoxie. Cette atténuation a été considérablement augmentée lorsque la distance spatiale était de 1,0 mm. Avec une distance de 2,0 mm, les CE atténuaient les lésions cm pendant l’hypoxie et l’hypoxie/réoxygénation, ce qui indique qu’une distance de culture suffisante est nécessaire pour que les CE puissent communiquer avec les CM, afin que les molécules de signal sécrétées puissent circuler et stimuler pleinement les voies protectrices. Nos résultats suggèrent, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture EC/CM est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des CE dans la protection contre la CM contre les lésions simulées d’ischémie / reperfusion. L’objectif de ce rapport est de fournir une approche étape par étape permettant aux enquêteurs d’utiliser cet important modèle à leur avantage.

Introduction

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde ^1,2. Cependant, le processus de traitement de la reperfusion peut lui-même provoquer la mort des cardiomyocytes, connue sous le nom de lésion d’ischémie / reperfusion myocardique (IR), pour laquelle il n’existe toujours pas de remède efficace³. Les cellules endothéliales (CE) ont été suggérées pour protéger les cardiomyocytes (CM) par la sécrétion de signaux paracrines, ainsi que par des interactions de cellule à cellule⁴.

Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule autocrine et/ou paracrine sur la fonction et la différenciation cellulaires. Parmi les modèles de co-culture, la co-culture mixte est la plus simple, où deux types différents de cellules sont en contact direct dans un seul compartiment de culture à un rapport cellulaire souhaité⁵. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables compte tenu de la population mixte.

Des études antérieures ont indiqué que les insultes hypoxiques et ischémiques causent des dommages importants à l’intégrité de la membrane cellulaire mesurée par la libération de lactate déshydrogénase (LDH). Cette blessure est aggravée lors de la réoxygénation, imitant la lésion de reperfusion ^6,7,8. L’objectif du protocole actuel était de tester les hypothèses selon lesquelles la présence d’EC peut atténuer en fonction de la dose les fuites de membrane cellulaire des CM causées par l’hypoxie et la réoxygénation (HR) et que l’effet protecteur des CE peut être optimisé en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires. Ainsi, nous avons utilisé trois types d’inserts de culture cellulaire et des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes. Les inserts, marqués par Corning, Merck Millipore et Greiner Bio-One, nous ont permis de créer trois conditions de diaphonie de culture cellulaire différentes avec des distances intercellulaires de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. 100 000 CE ont été plaqués par insert dans chaque cas.

De plus, afin de déterminer si la densité des CE en co-culture contribue à l’atténuation des lésions HR dans ce modèle, nous avons étudié la relation dose-réponse entre la concentration d’EC et la libération de LDH par les CM. Les EC ont été plaqués à 25 000, 50 000 et 100 000 par insert, respectivement, dans l’insert de 2,0 mm.

Le présent rapport offre aux enquêteurs une approche étape par étape pour qu’ils utilisent cet important modèle à leur avantage.

Protocol

1. Préparation/placage expérimental Entretenez les CM et les CE conformément aux instructions du fabricant. Décongelez les deux lignées cellulaires lorsqu’elles arrivent des fournisseurs. Plaque dans des flacons T25 après avoir été lavée avec du milieu frais. Il est recommandé d’acheter chaque milieu de culture cellulaire auprès des mêmes fournisseurs que ceux auprès desquels les cellules ont été achetées. Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et …

Representative Results

Les trois types d’inserts (A, B, C) utilisés dans cette expérience ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur de l’insert à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement, (Figure 3) et qu’elles proviennent de fournisseurs différents (pour plus de détails, voir tableau des matériaux). Pour établir un modèle …

Discussion

Étapes critiques du protocole
Des modèles de co-culture cellulaire ont été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la cardioprotection. Comment créer deux couches distinctes avec une distance significative entre elles est donc crucial pour le développement d’un modèle de co-culture approprié. Un défi dans l’étude de la lésion simulée IR, c’est-à-dire HR, est que non seulement l’ischémie (hypoxie) elle-même, mais aussi la reperfusion (réoxygénation) aggravent le …

Materials

Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)	Celprogen Inc	11041-14	Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue
Automated Cell Counter Countess II	Invitrogen	A27977	Cell counting for calculating cell numbers
Bio-Safety Cabinet	Nuaire	NU425400	Cell culture sterile hood
Cell Culture Freezing Medium	Cell Biologics Inc	6916	Used for cell freezing for long term cell line storage
Cell Culture Incubator	Nuaire	Nu-5500	To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, humidified)
Cell Culture Incubator Gas Tank	A-L Compressed Gases	UN1013	Gas needed for cell culture incubator
Cell Culture Inserts A (0.5 mm)	Corning Inc	353095	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts B (1.0 mm)	Millicell Millipore	PIHP01250	Used for EC-CM co-culture
Cell Culture Inserts C (2.0 mm)	Greiner Bio-One	662640	Used for EC-CM co-culture
Centrifuge	Anstel Enterprises Inc	4235	For cell culture plating and passaging
CMs Cell Culture Flasks T25	Celprogen Inc	E11041-14	Used for CMs regular culture, coated by manufacturer
CMs Cell Culture Medium Complete	Celprogen Inc	M11041-14S	CMs culture complete medium
CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Celprogen Inc	M11041-14PN	CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement
CMs Cell Culture Plates 96 well	Celprogen Inc	E11041-14-96well	Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer
CMs Hypoxia Cell Culture Medium	Celprogen Inc	M11041-14GFPN	CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283	Counting slides used for cell counter
Cyquant LDH Cytotoxicity Kit	Thermo Scientific	C20301	LDH measurement kit
ECs Cell Culture Flasks T25	Fisher Scientific	FB012935	Used for ECs regular culture
ECs Cell Culture Medium Complete	Cell Biologics Inc	M1168	ECs culture complete medium
ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free	Cell Biologics Inc	M1168PF	ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement
ECs Cell Culture Plates 96 well	Fisher Scientific (Costar)	3370	Used for experiments of LDH measurement
ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution	Cell Biologics Inc	6950	Used for coating flasks and plates for ECs
ECs Hypoxia Cell Culture Medium	Cell Biologics Inc	GPF1168	ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	MT35011CV	FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance
Hypoxia Chamber	StemCell Technologies	27310	To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment
Hypoxia Chamber Flow Meter	StemCell Technologies	27311	To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed
Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)	A-L Compressed Gases	UN1956	Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)
Microscope	Nikon	TMS	To observe cell condition
Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)	Cell Biologics Inc	C57-6093	Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice
NUNC 15ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565269	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
NUNC 50ML CONICL Tubes	Fisher Scientific	12565271	For cell culture process, experiments, solution preparation etc.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662	Used for cell washing during culture or experiments
Plate Reader	BioTek Instrument	11120533	Colorimetric or fluorometric plate reading
Reaction 96 Well Palte (clear no lid)	Fisher Scientific	12565226	Used for LDH measurement plate reading
Trypsin/EDTA for CMs	Celprogen Inc	T1509-014	1 x sterile filtered and tissue culture tested
Trypsin/EDTA for ECs	Cell Biologics Inc	6914/0619	0.25%, cell cuture-tested