माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी के नोसिसेप्टिव सर्किट में रिकॉर्डिंग नेटवर्क गतिविधि
Summary
रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग में नेटवर्क-स्तरीय नोसिसेप्टिव गतिविधि की जांच के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी प्रौद्योगिकी और 4-एमिनोपाइरिडीन-प्रेरित रासायनिक उत्तेजना का संयुक्त उपयोग उल्लिखित है।
Abstract
रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग (डीएच) के भीतर विशिष्ट प्रकार के न्यूरॉन्स की भूमिकाओं और कनेक्टिविटी को रीढ़ की हड्डी के दर्द प्रसंस्करण को रेखांकित करने वाले सर्किटों का तेजी से विस्तृत दृश्य प्रदान करने के लिए तेजी से चित्रित किया जा रहा है। हालांकि, डीएच में व्यापक नेटवर्क गतिविधि के लिए इन कनेक्शनों के प्रभाव कम अच्छी तरह से समझे जाते हैं क्योंकि अधिकांश अध्ययन एकल न्यूरॉन्स और छोटे माइक्रोसर्किट की गतिविधि पर ध्यान केंद्रित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों (एमईए) का उपयोग, जो कई कोशिकाओं में विद्युत गतिविधि की निगरानी कर सकता है, तंत्रिका गतिविधि के उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प प्रदान करता है। यहां, 4-एमिनोपाइरिडीन (4-एपी) के साथ रासायनिक रूप से उत्तेजक डीएच सर्किट द्वारा प्रेरित डीएच गतिविधि का अध्ययन करने के लिए माउस रीढ़ की हड्डी के स्लाइस के साथ एमईए का उपयोग वर्णित है। परिणामी लयबद्ध गतिविधि सतही डीएच तक सीमित है, समय के साथ स्थिर है, टेट्रोडोटॉक्सिन द्वारा अवरुद्ध है, और विभिन्न स्लाइस झुकावों में जांच की जा सकती है। साथ में, यह तैयारी भोले जानवरों, पुराने दर्द के पशु मॉडल और आनुवंशिक रूप से परिवर्तित नोसिसेप्टिव फ़ंक्शन वाले चूहों से ऊतक में डीएच सर्किट गतिविधि की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान करती है। इसके अलावा, 4-एपी-उत्तेजित रीढ़ की हड्डी के स्लाइस में एमईए रिकॉर्डिंग का उपयोग रीढ़ की हड्डी डीएच में गतिविधि को बाधित करने के लिए उपन्यास एंटीनोसिसेप्टिव यौगिकों की क्षमता का आकलन करने के लिए तेजी से स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
रीढ़ की हड्डी डीएच के भीतर विशिष्ट प्रकार के निरोधात्मक और उत्तेजक इंटरन्यूरॉन्स की भूमिकाओं को तेजी से 1,2,3,4 पर उजागर किया जा रहा है। साथ में, इंटरन्यूरॉन्स डीएच में 95% से अधिक न्यूरॉन्स बनाते हैं और संवेदी प्रसंस्करण में शामिल होते हैं, जिसमें नोसिसेप्शन भी शामिल है। इसके अलावा, ये इंटरन्यूरॉन सर्किट यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि परिधीय संकेत मस्तिष्क तक पहुंचने के लिए न्यूरोएक्सिस पर चढ़ते हैं और दर्द 5,6,7 की धारणा में योगदान करते हैं। आज तक, अधिकांश अध्ययनों ने इन विट्रो इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, न्यूरोएनाटोमिकल लेबलिंग और विवो व्यवहार विश्लेषण 1,3,8,9,10,11,12,13,14 के संयोजन का उपयोग करके विश्लेषण के एकल-कोशिका या पूरे जीव स्तर पर डीएच न्यूरॉन्स की भूमिका की जांच की है। . इन दृष्टिकोणों ने दर्द प्रसंस्करण में विशिष्ट न्यूरॉन आबादी की भूमिका की समझ को काफी उन्नत किया है। हालांकि, यह समझने में एक अंतर बना हुआ है कि विशिष्ट सेल प्रकार और छोटे मैक्रो-सर्किट माइक्रोसर्किट स्तर पर न्यूरॉन्स की बड़ी आबादी को कैसे प्रभावित करते हैं ताकि बाद में डीएच, व्यवहार प्रतिक्रियाओं और दर्द के अनुभव के आउटपुट को आकार दिया जा सके।
एक तकनीक जो मैक्रो-सर्किट या बहुकोशिकीय-स्तरीय फ़ंक्शन की जांच कर सकती है, वह माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) 15,16 है। एमईए का उपयोग कई दशकों17,18 के लिए तंत्रिका तंत्र समारोह की जांच करने के लिए किया गया है। मस्तिष्क में, उन्होंने न्यूरोनल विकास, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी, फार्माकोलॉजिकल स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण17,18 के अध्ययन की सुविधा प्रदान की है। उनका उपयोग विदेश मंत्रालय के प्रकार के आधार पर इन विट्रो और विवो अनुप्रयोगों दोनों के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विदेश मंत्रालय का विकास तेजी से विकसित हुआ है, विभिन्न इलेक्ट्रोड संख्याओं और कॉन्फ़िगरेशन के साथ अबउपलब्ध है 19. एमईए का एक महत्वपूर्ण लाभ कई इलेक्ट्रोड15,16 के माध्यम से उच्च स्थानिक और लौकिक सटीकता के साथ कई न्यूरॉन्स में विद्युत गतिविधि का एक साथ आकलन करने की उनकी क्षमता है। यह एक व्यापक रीडआउट प्रदान करता है कि न्यूरॉन्स सर्किट और नेटवर्क में, नियंत्रण स्थितियों के तहत और स्थानीय रूप से लागू यौगिकों की उपस्थिति में कैसे बातचीत करते हैं।
इन विट्रो डीएच तैयारी की एक चुनौती यह है कि चल रही गतिविधि का स्तर आमतौर पर कम होता है। यहां, इस चुनौती को डीएच सर्किट को रासायनिक रूप से उत्तेजित करने के लिए वोल्टेज-गेटेड के + चैनल अवरोधक, 4-एमिनोप्राइडिन (4-एपी) का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी के डीएच सर्किट में संबोधित किया जाता है। इस दवा का उपयोग पहले तीव्र रीढ़ की हड्डी के स्लाइस के डीएच में लयबद्ध तुल्यकालिक विद्युत गतिविधि स्थापित करने के लिए किया गया है और विवो स्थितियों में तीव्र 20,21,22,23,24 के तहत। इन प्रयोगों ने 4-एपी-प्रेरित गतिविधि 20,21,22,23,24,25 को चिह्नित करने के लिए एकल-कोशिका पैच और बाह्य रिकॉर्डिंग या कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग किया है। साथ में, इस काम ने लयबद्ध 4-एपी-प्रेरित गतिविधि के लिए उत्तेजक और निरोधात्मक सिनैप्टिक ट्रांसमिशन और विद्युत सिनैप्स की आवश्यकता का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, 4-एपी प्रतिक्रिया को एक ऐसे दृष्टिकोण के रूप में देखा गया है जो दवा-प्रेरित एपिफेनोमेना के बजाय जैविक प्रासंगिकता के साथ देशी पॉलीसिनेप्टिक डीएच सर्किट को अनमास्क करता है। इसके अलावा, 4-एपी-प्रेरित गतिविधि न्यूरोपैथिक दर्द की स्थिति के रूप में एनाल्जेसिक और एंटीपीलेप्टिक दवाओं के लिए एक समान प्रतिक्रिया प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करती है और इसका उपयोग उपन्यास रीढ़ की हड्डी आधारित एनाल्जेसिक दवा लक्ष्यों जैसे कि कॉनेक्सिन20,21,22 का प्रस्ताव करने के लिए किया गया है।
यहां, मैक्रो-सर्किट, या विश्लेषण के नेटवर्क स्तर पर इस नोसिसेप्टिव सर्किट्री का अध्ययन करने के लिए 4-एपी के साथ रीढ़ की हड्डी के डीएच के एमईए और रासायनिक सक्रियण को जोड़ने वाली तैयारी का वर्णन किया गया है। यह दृष्टिकोण भोले और न्यूरोपैथिक ‘दर्द जैसी’ स्थितियों के तहत नोसिसेप्टिव सर्किट की जांच के लिए एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मंच प्रदान करता है। यह तैयारी ज्ञात एनाल्जेसिक की सर्किट-स्तरीय कार्रवाई का परीक्षण करने और अति सक्रिय रीढ़ की हड्डी में उपन्यास एनाल्जेसिक को स्क्रीन करने के लिए भी आसानी से लागू होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नोसिसेप्टिव सिग्नलिंग, प्रोसेसिंग और परिणामस्वरूप व्यवहार और भावनात्मक प्रतिक्रियाओं में रीढ़ की हड्डी के डीएच के महत्व के बावजूद जो दर्द की विशेषता है, इस क्षेत्र के भीतर सर्किट खराब समझे जाते हैं।…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी) (बीएजी और आरजेसी को अनुदान 631000, 1043933, 1144638 और 1184974) और हंटर मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट (बीएजी और आरजेसी को अनुदान) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
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