6-hydroksydopamin rotte modell av Parkinsons sykdom

Summary

6-hydroksydopamin (6-OHDA) modellen har blitt brukt i flere tiår for å fremme forståelsen av Parkinsons sykdom. I denne protokollen demonstrerer vi hvordan du utfører ensidige nigrostriatale lesjoner i rotten ved å injisere 6-OHDA i medial forebrain-bunten, vurdere motoriske underskudd og forutsi lesjoner ved hjelp av trinntesten.

Abstract

Motoriske symptomer på Parkinsons sykdom (PD)-bradykinesi, akinesi og tremor i hvile-er konsekvenser av nevrodegenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra pars compacta (SNc) og dopaminergt striatal underskudd. Dyremodeller har blitt mye brukt til å simulere menneskelig patologi i laboratoriet. Gnagere er de mest brukte dyremodellene for PD på grunn av deres enkle håndtering og vedlikehold. Videre er anatomien og molekylære, cellulære og farmakologiske mekanismer for PD lik hos gnagere og mennesker. Infusjonen av nevrotoksinet, 6-hydroksydopamin (6-OHDA), i en medial forebrain bunt (MFB) av rotter reproduserer alvorlig ødeleggelse av dopaminerge nevroner og simulerer PD-symptomer. Denne protokollen demonstrerer hvordan man utfører den ensidige mikroinjeksjonen av 6-OHDA i MFB i en rottemodell av PD og viser motorunderskuddene indusert av 6-OHDA og predikerte dopaminerge lesjoner gjennom trinntesten. 6-OHDA forårsaker betydelig svekkelse i antall trinn utført med det kontralaterale forbenet.

Introduction

De viktigste nevropatologiske egenskapene til PD er kronisk progressiv nevrodegenerasjon av dopaminerge nevroner i substantia nigra pars compacta (SNc) og tilstedeværelsen av Lewy-organer som inneholder α-synukleinprotein1. Når SNc dopaminerge nevroner projiserer sine aksoner inn i striatum gjennom nigrostriatalveien, resulterer nevrodegenerasjon av nevroner i SNc i et dopaminergt underskudd i striatum2. Fraværet av dopamin i striatum forårsaker en ubalanse i aktivitetene til de direkte og indirekte motoriske kontrollveiene, som er ansvarlig for de viktigste motoriske symptomene på PD: akinesia (langsom bevegelse), bradykinesi (vanskeligheter med å starte bevegelser), muskelstivhet og tremor i ^hvile3,4,5.

Ettersom de molekylære og fysiologiske mekanismene som er involvert i utbruddet av PD fortsatt ikke er fullt ut forstått, søker tilgjengelige hovedbehandlinger å lindre de motoriske symptomene gjennom farmakoterapier, dyp hjernestimulering6,7, genetiske ^terapier8 og ^{celletransplantasjon9}. Derfor er preklinisk forskning grunnleggende for å belyse mekanismene som er involvert i utbruddet av PD og oppdage nye metoder for tidlig diagnose og nye terapier for å forhindre eller stoppe degenerasjon av nevroner påvirket av ^PD10.

Dyremodeller har blitt mye brukt til å simulere menneskelig patologi i laboratoriet, noe som bidrar til fremme av medisin og vitenskap11,12,13,14. Det er imidlertid viktig å understreke at riktig valg av dyremodell er grunnleggende for studiens suksess. Derfor må dyremodellen valideres i tre hovedaspekter: i) møte gyldighet, der dyremodellen må ha egenskapene til menneskelig patologi; ii) konstruktiv gyldighet, der dyremodellen må ha et solid teoretisk grunnlag; og iii) prediktiv gyldighet, der dyremodeller må reagere på behandlinger på samme måte som klinisk behandling.

For tiden brukes flere dyr som dyremodeller for PD. Hovedgruppene inkluderer pattedyr, som gnagere, primater, minipigs, hunder og katter, og andre grupper som drosophila og sebrafisk. Gnagere er den mest klassiske dyremodellen for PD og den mest brukte på grunn av deres enkle håndtering og vedlikehold. I tillegg er anatomien og molekylære, cellulære og farmakologiske mekanismer for PD lik hos gnagere og ^mennesker15.

En gjennomgang publisert av Kin og kolleger i 2019 analyserte de viktigste dyremodellmetodene som ble brukt til PD på 2000-tallet og fant at den mest brukte dyremodellen involverte nevrotoksiner som 6-hydroksydopamin (6-OHDA) og 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP). Begge nevrotoksiner forårsaker mitokondriedysregulering i dopaminerge nevroner i nigrostriatalbanen, noe som fører til ^celledød16. En annen mye brukt modell innebærer genetisk manipulasjon gjennom mutasjon i spesifikke gener involvert i utbruddet av PD, forårsaker mitokondrie ^{dysregulering17}. Neurotoksinmodeller brukes ofte til å evaluere og sammenligne terapeutiske behandlinger, mens genetiske modeller brukes til å studere utviklingen av forebyggende terapier og idiopatisk ^PD15.

Nevrotoksinet MPTP ble oppdaget å forårsake parkinsonisme på midten av 1980-tallet etter at syv pasienter brukte stoffet og viste alvorlige PD-symptomer. I tillegg til symptomene reagerte pasientene på behandling med L-DOPA, noe som fikk forskerne til å koble molekylet direkte til PD. Etter at saken ble publisert i 1986, begynte flere forskere å bruke MPTP i preklinisk ^{PD-forskning18}. Forskere har funnet ut at som et lipofilt molekyl kan MPTP krysse blod-hjernebarrieren (BBB) og konverteres til MPP ^{+ 19}. Dette giftige stoffet akkumuleres inne i nevroner og forårsaker skade på komplekse 1 av mitokondrie-luftveiene, noe som fører til død av dopaminerge ^nevroner20.

6-OHDA nevrotoksinmodellen ble først brukt til å indusere degenerasjon av monoamin nevroner av nigrostriatalbanen i 196821. 6-OHDA-modellen brukes ofte til å forårsake nevrodegenerasjon i nigrostriatalbanen, da den er en dopaminanalog og giftig for katekolaminholdige celler. Etter at 6-OHDA kommer inn i hjernen, kan den tas opp av dopamintransportøren (DAT) i dopaminerge nevroner, noe som fører til degenerasjon av nigrostriatalbanen22. Fordi 6-OHDA ikke trenger inn i BBB, må den administreres direkte gjennom intracerebral stereotaxic ^injeksjon23. En noradrenalin reopptakshemmer kombineres ofte med 6-OHDA mikroinjeksjon for å bevare noradrenalinske fibre og gi en mer selektiv degenerasjon av dopaminerge ^nevroner24.

Etter at DAT tar opp 6-OHDA, vil det akkumuleres i cytosol av nevroner, produserer reaktive oksygenarter (ROS) og fører til ^celledød15. Tre forskjellige lesjonsmodeller av 6-OHDA brukes ofte: i) lesjoner til ^SNc25,26; ii) lesjoner til ^{striatum27,28}; iii) lesjoner til ^MFB29,30. Lesjoner forårsaket i striatum resulterer i en langsom og retrograd degenerasjon av dopaminerge nevroner i SNpc. I motsetning resulterer lesjoner forårsaket i SNpc og MFB i rask og total degenerasjon av nevroner, noe som fører til mer avanserte parkinsonsymptomer31.

Ensidig eller bilateral injeksjon av 6-OHDA kan forårsake nevrodegenerasjon hos dopaminerge nevroner. 6-OHDA forårsaker ikke alltid alvorlig skade på nevronene; Noen ganger resulterer injeksjonen i delvis skade, som også brukes til å simulere de tidlige stadiene av ^PD32. Den ensidige injeksjonen brukes oftere på grunn av modellens evne til å vurdere dyrets motoriske underskudd og forutsi celletap gjennom tester som amfetamin / apomorfinindusert rotasjon og stepping ^test29. Bilaterale injeksjoner brukes mest til å evaluere romlig minne og ^{anerkjennelse33}.

Amfetamin/apomorfinindusert rotasjonstest er en atferdstest som vanligvis brukes til å forutsi celletap i nigrostriatalbanen. Det er definert som en prosess der gjentatt administrering av dopaminagonister fører til en intensivering av rotasjonsadferd hos 6-OHDA-leioned ^dyr34. Rotasjonsadferd består av kvantifisering av amfetaminindusert ipsilateral rotasjon eller apomorfininduserte kontralaterale svinger hos ensidig lesjonerte gnagere. Narkotikaindusert rotasjonsadferd har blitt kritisert fordi rotasjon ikke samsvarer med PD-symptomer hos mennesker og kan påvirkes av variabler som toleranse, sensibilisering og “priming”³⁵.

Grunning er en av de mest kritiske faktorene i disse atferdstestene. Noen tilfeller har blitt rapportert hvor en enkelt dose L-DOPA førte til en svikt i ^{rotasjonsatferd36}. I tillegg er en annen kritisk faktor knyttet til den kombinerte anvendelsen av den amfetamininduserte testen og apomorfinindusert test for parallell bruk at de måler forskjellige endepunkter på grunn av forskjellige virkningsmekanismer, noe som gjenspeiler inaktiveringen av forskjellige signalmekanismer og veier. Videre er den amfetamininduserte testen mer nøyaktig for å måle nigrostriatale lesjoner over 50-60%, mens den apomorfininduserte testen er mer nøyaktig for lesjoner over 80% ³⁷.

Stepping testen har dukket opp som en atferdstest som indikerer underskudd relatert til dopaminerg nevron degenerasjon og terapeutiske effekter. Det muliggjør analyse av akinesi forårsaket av en 6-OHDA lesjon i dopaminerge nevroner uten en legemiddelindusert prosedyre. Videre har testen vært veletablert og ofte brukt siden 1995, da den først ble beskrevet av Olsson et ^al.35. I 1999 analyserte og sammenlignet Chang et ^al.38 også ytelsen til rotter i trinntesten med nivået av degenerasjon forårsaket av 6-OHDA og fant at dyr som utførte verre i trinntesten også hadde en mer signifikant degenerasjon av dopaminerge nevroner.

Stepping testen er en utmerket metode for å forutsi alvorlig dopaminerg nigrostriatal skade i 6-OHDA-leioned rotter. Bevis tyder på at motoriske underskudd vises i det kontralaterale forbenet av 6-OHDA-infusjonen under trinntesten når graden av dopaminerge tap i SNc er >90%³⁹. Dette dokumentet beskriver protokollene, metodene og materialene som brukes til å utføre stereotaxisk kirurgi for ensidig infusjon av 6-OHDA i MFB av rotter og hvordan man forutsier dopaminerge lesjoner forårsaket av toksinet gjennom trinntesten.

Protocol

Alle prosedyrer som involverte dyr fulgte de etiske prinsippene i National Council for the Control of Animal Experimentation (CONCEA) og Arouca Law (Law 11.794/2008) og ble godkjent av den lokale etikkkomiteen (CEUA-FFCLRP/USP (18.5.35.59.5). 1. Fremstilling av narkotika Anestesi med Ketamin/XylazineMERK: Dosen av ketamin som brukes er 70 mg/kg, og dosen av xylazin er 10 mg/kg. For å tilberede 1 ml bedøvelse ved bruk av ketamin 100 mg/ml oppløsning og …

Representative Results

Dopaminerge lesjonsvurderingerTrinntesten gjør det mulig å vurdere akinesi av den fremre lemmen kontralateral til lesjonen og valg av dyr med en mulig lesjon av nigrostriatalbanen indusert av 6-OHDA infusjon (figur 1). Sammenligningen av ytelsen til den kontralaterale forelimb stepping test presurgery og 2 uker og 4 uker etter operasjonen avslørte interaksjon (F2,74 = 93.63; p < 0.0001; toveis gjentatte tiltak ANOVA) mellom tid (pre, 2, og 4 uker etter oper…

Discussion

Dette dokumentet beskriver en protokoll for å utføre kirurgi for ensidig mikroinfusjon av 6-OHDA i MFB, som er i stand til å forårsake robuste lesjoner i nevronene i nigrostriatalbanen og generere akinesi i dyret. Også beskrevet er protokollen for å utføre trinntesten, en lett anvendelig og ikke-invasiv test som kan brukes til å bevise suksessen til lesjonene og vurdere forelimb akinesia. Som presentert i de representative resultatene, viste dyr som fikk 6-OHDA en reduksjon i antall justeringstrinn kontralateralt…

Materials

6-OHDA	Sigma Aldrich	H4381	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h4381?lang=pt&region=BR&cm_sp=Insite-_-caSrpResults_srpRecs_srpModel _6-ohda-_-srpRecs3-1
70% Alcohol
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	795437	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/795437?lang=pt&region=BR&gclid= Cj0KCQjw4cOEBhDMARIsAA3XD RipyOnxOxkKAm3J1PxvIsvw09 _kfaS2jYcD9E5OyuHYr4n89kO 6yicaAot6EALw_wcB
Cotton
Drill or tap
Gauze
Hamilton syringe 50 uL	Hamilton	80539	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80539
Imipramine	Alfa Aeser	J63723	https://www.alfa.com/pt/catalog/J63723/
Infusion pump	Insight	EFF-311	https://insightltda.com.br/produto/eff-311-bomba-de-infusao-2-seringas/
Ketamine (Dopalen)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/DOPALEN
Machine for trichotomy
Meloxicam (Maxicam 2%  Ourofino)	Ourofino		https://terrazoo.com.br/produto/maxicam-injetavel-2-50ml-ouro-fino/
Metal Disposal
Paper towels
Pentabiotic	Zoetis		https://www.zoetis.com.br/pentabiotico-veterinario.aspx
Plastic waste garbage can
Poly-antibiotic	Pentabiotic (Wealth)
Povidone-iodine
Scalpel and blades
Scissors
Scraper
Stereotaxic apparatus	Insight	EFF-331	https://insightltda.com.br/produto/eff-331-estereotaxico-1-torre/
Sterile saline solution
Swabs
Temperature probe
Timer
Tweezers
Xylazine (Anasedan)	Ceva		https://www.ceva.com.br/Produtos/Lista-de-Produtos/ANASEDAN