Грызунные модели L-DOPA-индуцированных дискинезий являются бесценными инструментами для выявления терапевтических вмешательств для ослабления развития или облегчения проявлений, возникающих из-за повторного введения L-DOPA. Этот протокол демонстрирует, как индуцировать и анализировать дискинетические движения в одностороннем 6-OHDA-пораженном крысиной модели болезни Паркинсона.
L-DOPA-индуцированные дискинезии (LIDs) относятся к двигательным осложнениям, которые возникают в результате длительного введения L-DOPA пациентам с болезнью Паркинсона (PD). Наиболее распространенной картиной, наблюдаемой в клинике, является дискинезия пиковой дозы, которая состоит из клинических проявлений хореиформных, дистонических и баллистических движений. 6-гидроксидофаминовая (6-OHDA) крысиная модель PD имитирует несколько характеристик LID. После повторного введения L-DOPA у крыс с поражением 6-OHDA проявляются дискинетические движения (например, аномальные непроизвольные движения, ИМ). Этот протокол демонстрирует, как индуцировать и анализировать АИМ у крыс с поражением 6-OHDA с 90%-95% дофаминергическим истощением в нигростриатальном пути. Повторное введение (3 недели) L-DOPA (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида) может индуцировать развитие АИМ. Анализ временного курса выявляет значительное увеличение АИМ через 30-90 мин (дискинезия пиковой дозы). Грызунные модели LID являются важным доклиническим инструментом для выявления эффективных антидискинетических вмешательств.
Предшественник дофамина L-3,4-дигидроксифенилаланин (L-DOPA) представляет собой наиболее эффективное лечение двигательных симптомов болезни Паркинсона (PD)1. Терапия L-DOPA может улучшить двигательные симптомы, связанные с БП, но со временем теряет эффективность. Двигательные колебания, такие как «флуктуация износа» или «ухудшение в конце дозы», клинически проявляются как укороченная продолжительность эффекта однократных доз L-DOPA2. В других случаях клинические проявления состоят из медленных скручивающих движений и аномальных поз (дистония)3 и возникают, когда уровень дофамина низкий (внепериодическая дистония)4. С другой стороны, L-DOPA-индуцированные дискинезии (LIDs) появляются, когда уровни дофамина в плазме и мозге высоки5.
ЛИДы вызывают изнурительные побочные эффекты, которые включают двигательные осложнения, такие как хореиформные, дистонические и баллистическиедвижения 6. После установки LID возникают после каждого введения L-DOPA. Двигательные осложнения возникают у 40%-50% пациентов с БП, проходящих терапию L-DOPA в течение 5 лет, а заболеваемость увеличивается с течением7 лет. Хотя патофизиологические механизмы, участвующие в развитии LID у пациентов с БП, еще не полностью выяснены, степень дофаминергической денервации, пульсирующее введение L-DOPA, последующие изменения в стриатальных белках и генах, а также аномалии в недофаминовых передающих системах являются факторами, которые способствуют развитию этих нежелательных побочных эффектов 6,8,9,10.
Нейротоксин 6-гидроксидофамин (6-OHDA) является хорошо охарактеризованным инструментом для изучения БП у грызунов 11,12,13,14. Поскольку 6-OHDA не пересекает гематоэнцефалический барьер, его необходимо вводить непосредственно в нигростриатальный путь. 6-OHDA-индуцированное дофаминергическое истощение зависит от концентрации и участка15. Одностороннее введение 6-OHDA в медиальный пучок переднего мозга (MFB) может привести к тяжелому (>90%) нигростриатальному повреждению у грызунов 16,17,18,19. Хроническое введение L-DOPA тяжелым односторонне 6-OHDA-пораженным грызунам вызывает появление дискинетических движений, называемых аномальными непроизвольными движениями (AIMs). Дискинетические движения у грызунов имеют сходные молекулярные, функциональные и фармакологические механизмы, связанные с ЛИД у пациентов с БП5. Таким образом, 6-OHDA-пораженные крысы20 и мыши21 являются ценными доклиническими моделями для изучения LID. При хроническом лечении (7-21 день) терапевтическими дозами L-DOPA (5-20 мг/кг) в одностороннем порядке у крыс и мышей с поражением 6-OHDA наблюдается постепенное развитие АИМ, которые влияют на передние, туловищные и орофациальные мышцы, противоположные поражению 17,18,19,20,22,23,24 . Эти движения представлены на временном курсе, аналогичном L-DOPA-индуцированным дискинезиям пиковой дозы у пациентов с БП25 и характеризуются гиперкинетическими движениями и дистонией5. AIM обычно оцениваются на основе их тяжести (например, когда присутствует определенный AIM) и амплитуды (например, характеризуется амплитудой каждого движения) 5,23,25.
Модели 6-OHDA-пораженных грызунов LID представляют валидность лица (т.е. модель имеет несколько характеристик, которые выглядят как состояние человека)5,11,26,27,28. AIM грызунов, аналогичные тому, что происходит у пациентов с БП, рассматриваются как гиперкинетические (передние и оролингвальные) и дистонические (осевые) движения29 и имитируют дискинезию пиковой дозы. На молекулярном и функциональном уровне модели грызунов имеют много общих патологических характеристик с пациентами с БП5, таких как повышение регуляции FosB/ ΔFosB 19,26,30,31,32,33 и переносчика серотонина (SERT)34,35 . Что касается прогностической валидности, препараты, которые снижают LID у пациентов с БП (например, антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) амантадин), представляют антидискинетическую эффективность в модели грызунов 22,36,37,38,39.
Рейтинговая шкала AIMs грызунов была создана на основе четырех подтипов AIM, которые включают AIM, влияющие на голову, шею и туловище (осевые AIM), гиперкинетические движения передних конечностей (AIM конечностей) и дискинетические оролингвальные движения (orolingual AIMs). Хотя контралатеральное вращение (локомотивные AIM) также присутствует у односторонне пораженных грызунов 20,22,23,25,40, оно не было оценено как дискинетическое движение, поскольку оно не может представлять собой конкретную меру LID 22,37,41.
Здесь мы опишем, как индуцировать и анализировать дискинетические движения (осевые, конечностные и оролингвальные АИМ) в тяжелой (>90%) односторонне 6-OHDA-пораженной крысиной модели БП. Мы организовали наш протокол на основе предыдущей литературы и нашего лабораторного опыта.
Этот протокол демонстрирует, как индуцировать и анализировать AIM в крысиной модели PD, индуцированной односторонней микроинъекцией 6-OHDA в MFB. Хроническое ежедневное введение низких доз L-DOPA (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида) приводило к развитию АИМ в течение 3 недель лечения. Врем?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP, грант 2017/00003-0). Мы благодарны за Координацию по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES). Мы благодарим д-ра Энтони Р. Уэста, д-ра Хайнца Штайнера и д-ра Куэй Й. Ценга за поддержку и наставничество.
6-hydroxydopamine hydrobromide | Sigma-Aldrich, USA | H6507 | Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals |
Benzerazide hydrochloride | Sigma | B7283 | Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor |
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI) 2.8mm B | HIKVISION | DS-2CE16C0T-IRP | Camera used to record all behavior |
Imipramine hidrochloride | Alfa Aesar | J63723 | Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA |
Ketamine hydrochloride | Ceva Animal Health | Anesthesia for surgical intervention | |
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) | Cayman Chemical Company | 16149 | Dopamine precursor |
Mirrors | Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions | ||
Needles 0.30 x 13 mm | PrecisionGlide | Needles used to inject drugs | |
Sodium chloride (NaCl) | Samtec | Salt | |
Syringes 1 ml Sterile | BD Plastipak | Syringes used to inject drugs | |
Transparent cylinders | Used to record animal behavior during experiments | ||
Xylazine hydrochloride | Ceva Animal Health | Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention |