여기에서 정의 된 프로테오올리포솜의 완전히 정제 된 구성 요소로 Msp1 추출 활동을 재구성하기위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
산화 인산화 및 세포제 조절의 중심지인 미토콘드리아는 인간의 건강에 중요한 역할을 합니다. 적절한 미토콘드리아 기능은 단백질 항상성(proteostasis)을 유지하기 위한 견고한 품질 관리 시스템에 달려 있습니다. 미토콘드리아 프로테오스타증의 감소는 암, 노화, 신경 변성 및 기타 많은 질병과 관련이 있습니다. Msp1은 잘못 지역화된 꼬리 고정 단백질을 제거하여 프로테오스타시스를 유지하는 외부 미토콘드리아 막에 고정된 AAA+ ATPase입니다. 프로테오올리푸좀으로 재구성된 정제 성분을 사용하여, 우리는 Msp1이 지질 이중층에서 모형 꼬리 고정 단백질을 추출하는 데 필요하고 충분하다는 것을 보여주었습니다. 우리의 단순화 된 재구성 시스템은 막 단백질 추출의 상세한 연구를 방해 한 기술적 장벽의 몇 가지 극복. 여기서, 우리는 리포솜, 막 단백질 재구성 및 Msp1 추출 분석의 생성을 위한 상세한 방법을 제공합니다.
서론
적절한 세포 기능은 프로테오스타시스라는 공정에 따라 달라지며, 이는 기능성 단백질이 올바른 농도 및 세포 위치1에있는지 확인합니다. 프로테오스타증의 실패는 손상된 세포간 기능으로 이어지며 많은 신경 퇴행성질환2,3,4와연관된다. 멤브레인 단백질은 소수성 막 도메인(TMDs)5로부터응집되는 것을 피하면서 올바른 멤브레인을 대상으로 해야 하기 때문에 프로테오스타증 네트워크에 고유한 과제를 제시한다. 따라서, 특수기계는 사이토솔으로부터 소수성 TMD를 보호하고 적절한 세포막6,7,8,9,10,11,12,1....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 리포솜 준비
- 지질의 클로로폼 스톡을 적절한 비율로 결합하여 외부 미토콘드리아 막을 모방합니다.
- 지질 혼합물 25 mg을 준비합니다. 미토콘드리아 막을 모방한 지질의 이전에 확립된 혼합물을 사용하고, 48:28:10:10:4 닭고기 계란 인산단 콜린 콜린 (PC), 치킨 계란 인파디딜 에탄올라민 (PE), 소 간 인파디올 이노 시 톨 (PI), 합성 1,2-디오의 어금니 비율 [sn-glycero-3-phospho-L-serine] 및 합성 1',3'-비스[1,2-디오레오틸-센-글리세로-3-인포]-글리세롤(TOCL)58,59. 샘플 계산은 표 1에표시됩니다.
- 이 응축을 제한하기 때문에 열기 전에 모든 지질 주식을 실온에 가져. 대부분의 실험실은 지질의 농도를 측정하는 정확한 방법이 없기 때문에 클로로폼 스톡에 흡수되는 모든 물은 지질 재고의 농도를 변화시키고 따라서 분석에 사용되는 지질의 비율을 변화시합니다.
- 지질 재고가 유리 앰플에 들어오면 필요한 양의 지질을 1mL 주사기를 사용하여 유리 유리 병으로 옮기습니다. 지질 산화를 방지하기 위해 유리병에 디티오스레이톨(DTT)2 mg을 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
결과를 제대로 해석하려면 얼룩이없는 젤과 서부 얼룩을 함께 보아야합니다. 얼룩없는 젤은 모든 샘플에 걸쳐 동일한 로딩을 보장합니다. 얼룩 없는 젤을 볼 때, 샤페론(GST-칼모둘린 및 GST-SGTA)은 입력(I) 및 ELUTE(E) 레인에서 볼 수 있습니다. 이러한 대역의 강도가 모든 입력 샘플에서 균일한지 다시 확인합니다. 마찬가지로 ELUTE 샘플에서 강도가 균일하게 유지되도록 합니다. ELUTE는 입력보다 5배 더 농축되어 있으며 강도의 차이는 젤에서 볼 수 있습니다.
얼룩 없는 젤을 사용하여 적절한 하중을 확인한 후, 서풍 블롯을 검사하여 추출 활성을 결정합니다. 입력(I) 분획에 비해 ELUTE(E) 분획의 기판 양을 비교하여 추출 활동을 측정합니다. 유량 통과(FT)의 신호는 일부 가변성을 나타내지만 일반적으로 입력 분획과 유사합니다. WASH(W) 분획에는 신호가 없어야 합니다. 전형적으로, 음수 제어에 대한 양수 제어 및 1.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
적절한 미토콘드리아 기능은 강력한 단백질 품질 관리 시스템에 따라 달라집니다. TA 단백질 표적화 경로의 충실도에 내재된 한계로 인해 잘못 지역화된 TA 단백질은 미토콘드리아에 대한 지속적인 스트레스 원천입니다. 미토콘드리아 프로테오스테아증 네트워크의 핵심 성분은 OMM에서 잘못 국산화된 TA 단백질을 제거하는 멤브레인 고정 AAA+ ATPase인 Msp1입니다. 여기에서, 우리는 proteoliposomes를 준비하는 방법을 설명했습니다, 공동 재구성 Msp1 및 모형 TA 단백질, 추출 분석기를 능력을 발휘합니다. 우리는 이전에 Msp1이 잘못 된 TA 단백질을 직접 인식하고 어떤 액세서리 단백질이나 공동 요인없이 지질 이중 층에서 이러한 단백질을 추출 할 수 있음을 증명하기 위해이 분석기를 사용했다57.
분석의 단점은 재구성 과정에서 약간의 가변성이 있다는 것입니다. 준비-준비 가변성을 제어하기 위해, 우리는 항상 우리의 분석이 의.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
감사의 글
MLW는 시카고 대학의 로버트 키넌 박사와 함께 박사 후 연구 를 하는 동안이 프로토콜의 일부를 개발했습니다.
이 작업은 MLW에 NIH 보조금 1R35GM137904-01에 의해 투자된다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Biobeads | Bio-Rad | 1523920 | |
| 소 간 포스파티딜 이노시톨 | Avanti | 840042C | PI |
| 닭 달걀 포스파티딜 콜린 | Avanti | 840051C | |
| PC 닭 달걀 포스파티딜 에탄올아민 | Avanti | 840021C | PE |
| ECL SELECT WESTERN BLOTTING DETECTION 시약 | GE | RPN2235 | |
| 필터 지원 | Avanti | 610014 | |
| 유리 바이알 | VWR | 60910L-1 | |
| 글루타티온 스핀 컬럼 | Thermo Fisher | PI16103 | |
| 염소 방지 | Thermo Fisher | NC1050917 | |
| 미니 압출기 | Avanti | 610020 | |
| 폴리카보네이트 멤브레인 | Avanti | 610006 | 200 nM |
| PVDF 멤브레인 | Thermo Fisher | 88518 | 45 µ M |
| Rabbit anti-FLAG | Sigma-Aldrich | F7245 | |
| 합성 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti | 840035C | DOPS |
| 합성 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol | Avanti | 710335C | TOCL |
| 주사기, 1mL | Norm-Ject | 53548-001 | |
| 주사기, 1mL, 기밀 | 아반티 | 610017 |
참고문헌
- Song, J., Herrmann, J. M., Becker, T. Quality control of the mitochondrial proteome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22, 54-70 (2021).
- Phillips, B. P., Miller, E. A. Membrane protein folding and quality control. Current Opinion in Structural Biology.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
