시투에서 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레와 청소년의 혼성화
Summary
제브라피쉬는 신장 발달을 이해하는 중요한 모델입니다. 여기서, 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스 개발 중 제브라피시 애벌레및 청소년의 유전자 발현을 검출하도록 최적화된다.
Abstract
제브라피쉬는 일생에 두 개의 신장 구조를 형성합니다. 배아 발달 중 경향이 있는 (배아 신장)은 형성되고 2 일 후에 수정 후에 작동하기 시작합니다. 단지 두 개의 신전으로 이루어짐에 따라, 수성 세포는 증가하는 바디 질량 때문에 더 많은 신장 기능이 요구될 때까지 애벌레 생활 도중 유일한 신장 역할을 합니다. 이 높은 수요에 대처하기 위하여는, 메소네프로스 (성인 신장)는 변태 도중 형성하기 시작합니다. 새로운 기본 nephrons 는 경향이 있는 알 로에 융합 하 고 연결 된 lumens 형성. 그런 다음 보조 nephrons는 메소네프로스(mesonephros)에 분기 네트워크를 만들기 위해 기본 nephrons에 융합됩니다. 연구의 대다수는 배아를 사용 의 용이성 때문에 경향이 있는 phros에 집중됩니다. 따라서 메소네프로스의 발달을 더 잘 이해하기 위해 더 오래되고 더 큰 애벌레와 청소년 물고기를 연구하는 기술을 개발할 필요가 있습니다. 여기서, 유전자 발현 분석을 위한 시투 혼성화 프로토콜은 메소네프로스를 더 잘 시각화하기 위해 프로브 침투, 프로브 및 항체의 세척 및 표백에 최적화되어 있다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 전구 세포와 초기 신장의 말단 튜블러를 라벨에 사용됩니다. 이 프로토콜은 메손프로스 연구의 격차를 메손프로스(mesonephros) 연구의 격차를 메웁니다. 새로운 신장 조직이 어떻게 형성되고 기존 신장론과 통합되고 재생 치료에 대한 통찰력을 제공하는지 이해하는 중요한 모델입니다.
Introduction
Zebrafish 배아는 최대 5 일 1,2에 대한 먹이없이 작은 크기, 투명성, 사용 가능한 도구 및 생존으로 인해 조직 발달을 연구하기위한 중요한 모델입니다. 그것은 크게 신장 발달의 이해와 제브라피시와 포유류 사이의 보존에 기여하고있다3,4,5. 신장은 유체 항상성을 유지하고 혈액을 필터링하고 폐기물을 배설하는 데 필수적인 역할을합니다. 신장의 기능성 단위인 네프론은 긴 튜블러에 연결된 혈액 필터를 포함한다. 제브라피시에서는 두 개의 신장 구조가 평생 동안 형성됩니다. 수경향 (임시 배아 신장) 초기 발달 도중 첫번째 양식. 전방 후방 축을 따라 실행되는 두 개의 네프론으로 구성되어 있으며 약 2일 후에 발효됩니다(dpf). 경향이 있는 소염의 유용성은 단순성에 있으며, 대부분 선형적이고 시각화하기 쉬운 두 개의 네프론을 가지고 있습니다 (근위 복잡한 튜블러는 3 dpf에서 코일되기 시작하지만). 이것은 중간 중음에서 초기 발달의 연구뿐만 아니라 세분화 패턴 및 tubule 수리7,8을 촉진했습니다.
노른자가 감소하고 유충이 수생 계통9에서 먹이에 의존할 때 제브라피시의 유용성은 5dpf 후에 제한됩니다. 약 2 주 에서, 애벌레는 새로운 조직 양식 및 오래된 조직이 분실되고/또는 개편되는 청소년으로 변태를 겪습니다9. 이것은 또한 메소네프로스 (영구 성인 신장)가 10,11,12를 형성 할 때입니다. 첫 번째 성인 nephron 여섯 번째 소밋 근처 형성, 그리고 경향이 있는 phros의 탈경 초기 tubule와 융합. 추가 nephrons는 처음에이 위치에 후방을 추가, 뿐만 아니라 나중에 전방으로. 이 첫 번째 파도의 기본 네프론은 경향이있는 사람의 튜블러에 융합하고 폐기물을 입금하기 위해 일반적인 루멘을 공유합니다. 보조 nephrons다음 파도에서 형성 하 고 기본 nephrons에 융합. 이 반복적인 과정은 포유류 신장에 다소 유사한 분기되는 메손프로스를 만듭니다. 아마도, 경향이 있는 것은 결국 그것의 관 정체성을 잃고 모든 nephrons그들의 낭비를 배수하는 두 개의 중요한 수집 덕트가 됩니다13.
첫 번째 성인 nephron의 형성 전에, 단 하나 전구 세포는 ~4 mm (총 길이) 애벌레 (~10 dpf)에서 나타나기 시작합니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선에 표시된 이 세포는, 경향이 있는 phros를 고착하고 신뢰의 미래 사이트로 이동하는 것처럼 보입니다. 단일 세포는 새로운 nephrons12로 분화하는 클러스터로 결합합니다. 이 세포가 어디에 상주하는지 또는 메소네프로 발생의 발병 전에 어떤 유전자를 표현하는지 불분명합니다.
메손프로스 개발을 이해하면 포유류 신장에 대한 통찰력을 수성세포증이 할 수 없는 방식으로 얻을 수 있습니다. 이들은 단 하나 전구 세포에서 nephrogenic 골체의 형성, 기존 세포와 새로운 nephrons의 기능적인 통합, 및 분진 형태를 포함합니다. 그러나, 태아 발달을 공부하는 한계가 있습니다. 유충은 그들의 더 큰 크기와 색소 침착을 가지고 있기 때문에 덜 투명합니다. 개발 타임 라인은 개별 동물 중 동기가 아니며 먹이 주기 및 혼잡9,14와 같은 환경 요인에 크게 의존합니다. 녹다운 시약이 존재하지만, 배아15에 비해 애벌레에서 덜 효과적입니다. 본 프로토콜에서, 제브라피시 메소네프로스 개발 중 유전자 발현을 결정하는 시투 혼성화 방법이 기재된다. 몇 가지 단계는 메손프로스의 시각화와 프로브 및 항체의 침투 및 세척을 증가시키기 위해 최적화된다. Tg(lhx1a-EGFP) 형질전환선은 EGFP가 단일 전구 세포, 신장 골체 및 초기 신장의 단면 튜블러를 라벨에 부착하기 위한 프로브와 함께 사용됩니다. 이 방법은 메소네프로스 발달에 대한 깊은 이해와 재생 치료에 대한 통찰력을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 시투 혼성화 방법은 메소네프로스 개발을 연구하는 것을 목표로 합니다. 그러나, 그것은 창 자, 신경계, 비늘 및 색소 침착14와 같은 변태 도중 그밖 조직 및 기관의 발달을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 프로브는 형질 전환선에서 내인성 유전자 또는 형광 마커를 위해 생성될 수 있다.
애벌레는 그들의 네이티브 맥락에서 장기?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기금은 펜실베니아 과학 아카데미, 펜실베니아 생물학자의 연방, 펜실베니아 인디애나 대학 (대학원 연구 및 연구, 생물학부 및 신시아 수삭 학부 생물학 기금)에 의해 제공되었습니다. Tg (lhx1a-EGFP) 형질 전환선은 박사 닐 Hukriede에 의해 제공되었다 (피츠버그 대학).
Materials
| Anti-fluorescein antibody | Roche/Sigma-Aldrich | 11426338910 | |
| Bleaching solution | 0.8% KOH, 0.9% H2O2 in PBST | ||
| Blocking reagent | Roche/Sigma-Aldrich | 11096176001 | Use for blocking solution, prepare according to manufacture's instruction |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | 100 μm |
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, 0.0001% methylene blue | ||
| Eyelash manipulator | Fisher Scientific | NC1083208 | Use to manipulate larvae |
| Fixing solution | 4% paraformaldehyde, 1% DMSO in PBS; heat at 65°C while shaking until the powder dissolves, then add DMSO after it cools down | ||
| Fluorescein probe synthesis | Roche/Sigma-Aldrich | 11685619910 | |
| Glass vial | Fisher Scientific | 03-338B | |
| Hatchfry encapsulation | Argent | ||
| Hyb- solution | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Hyb+ solution | HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin | ||
| MAB (10X) | 1 M maleic acid, 1.5 M NaCl, pH 7.5 | ||
| MABT | 1X MAB, 0.1% Tween-20 | ||
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
| PBS (10X) | 8% NaCl, 0.2% KCl, 1.44% Na2HPO4, 0.24% KH2PO4 | ||
| PBST | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBST2 | 1X PBS, 0.2% Tween-20 | ||
| Powder food | Mix 2 g of each of spirulina and hatchfry encapsulon in 50 mL of fish system water and shake well | ||
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P5568 | Use to permeabilize larvae |
| Proteinase K solution | 20 μg/mL, 1% DMSO final concentration in PBST | ||
| Spirulina microfine powder | Argent | ||
| SSC (20X) | 3 M NaCl, 0.3 M sodium acetate anhydrous, pH 7, autoclave | ||
| SSCT (0.2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| SSCT (2X) | Dilute from 20X SSC, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining buffer | 100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20 | ||
| Staining solution | 200 μg/mL iodonitrotetrazolium chloride, 200 μg/mL 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt, in staining buffer | ||
| Stopping solution | 1 mM EDTA, pH 5.5, in PBST | ||
| Torula (yeast) RNA | Sigma-Aldrich | R6625 | |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | 2%, pH 7 |
| Wash buffer | 50% formamide, 2X SSC, 0.1% Tween-20 |
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