تلطيخ الفلورسنت المناعي متعدد الخلايا المناعية من أربعة أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الإجهاض المتكرر
Summary
على الرغم من التقدم في الكيمياء المناعية المتعددة والتصوير متعدد الأطياف ، فإن توصيف كثافة وتتجمع الخلايا المناعية الرئيسية في وقت واحد في بطانة الرحم لا يزال يشكل تحديا. تصف هذه الورقة بروتوكول تلطيخ متعدد المضاعفات مفصل وتصوير للتوطين المتزامن لأربعة أنواع من الخلايا المناعية في بطانة الرحم.
Abstract
الكيمياء المناعية هي الطريقة الأكثر استخداما لتحديد وتصور مستضدات الأنسجة في البحوث البيولوجية والتشخيص السريري. ويمكن استخدامه لوصف العمليات البيولوجية المختلفة أو الأمراض، مثل التئام الجروح، والاستجابة المناعية، ورفض الأنسجة، والتفاعلات بين الأنسجة والمواد الحيوية. ومع ذلك، فإن تصور وتكميم المستضدات المتعددة (خاصة للخلايا المناعية) في قسم واحد من الأنسجة باستخدام تلطيخ المناعة الكيميائية التقليدية (IHC) لا يزال غير مرض. ومن ثم، تم إدخال تقنيات متعددة العينات في السنوات الأخيرة لتحديد علامات بيولوجية متعددة في عينة نسيج واحدة أو مجموعة من عينات الأنسجة المختلفة.
يمكن أن تكون هذه التقنيات مفيدة بشكل خاص في التفريق بين التغيرات في التفاعلات بين الخلايا المناعية داخل بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء اللواتي يجهضن المتكررة أثناء الزرع. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ IHC الفلوري المتعدد الفلور للتحقيق في كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في وقت واحد في عينات بطانة الرحم في الوقت المحدد بدقة أثناء زرع الجنين. تتضمن الطريقة إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، تليها تحليل البيانات ، مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم.
باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل كثافة وتتجمع أربعة أنواع رئيسية من الخلايا المناعية في بطانة الرحم في وقت واحد في قسم واحد من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، ستناقش هذه الورقة العوامل الحرجة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للتغلب على التداخل المحتمل للفلوروفور بين المسابير الفلورية التي يتم تطبيقها. والأهم من ذلك، يمكن أن تساعد نتائج تقنية تلطيخ متعددة المضاعفات هذه في توفير فهم متعمق للتفاعل المناعي والتنظيم أثناء زرع الجنين.
Introduction
يمكن تعريف الإجهاض المتكرر (RM) بأنه فقدان حملين أو أكثر قبل 24 أسبوعا من الحمل1. هذه الحالة الإنجابية المتكررة تؤثر على ما يصل إلى 1٪ من الأزواج في جميع أنحاء العالم2،3. الفيزيولوجيا المرضية متعددة العوامل ويمكن تقسيمها إلى أسباب مدفوعة جنينيا (ويرجع ذلك أساسا إلى النمط الكاريوتيبي الجنيني غير طبيعي) والأسباب المدفوعة الأمهات التي تؤثر على بطانة الرحم و / أو نمو المشيمة. يمكن أن ينتج هذا المظهر عن التشوهات الوراثية الأبوية ، شذوذ الرحم ، الظروف البروتيمبوتيكية ، عوامل الغدد الصماء ، والاضطرابات المناعية4.
في السنوات الأخيرة، وقد تورط ضعف الخلايا المناعية التأثير في الإمراض من فقدان الحمل المبكر5. وقد ألهم هذا العديد من التحقيقات في توضيح مجموعات محددة من الخلايا المناعية في بطانة الرحم خلال الدورة الشهرية، والزرع، والحمل المبكر، مع أدوار محددة في الحمل المبكر. من بين هذه الخلايا المناعية، تلعب خلايا القاتل الطبيعي الرحمي (uNK) دورا حاسما أثناء زرع الجنين والحمل، لا سيما في عمليات الغزو الأرومي الترموغي وتولد الأوعية6. وقد أظهرت الدراسات زيادة كثافة خلايا UNK في بطانة الرحم للنساء مع RM 7,8, علىالرغممن أن هذه النتيجة لم تكن مرتبطة بزيادة خطر الإجهاض9. ومع ذلك، حفز هذا البحث تقييم كثافة أنواع الخلايا المناعية الأخرى (مثل الضامة، والخلايا التغصن الرحمي) في بطانة الرحم في النساء مع RM10،11. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير المؤكد ما إذا كان هناك تغيير كبير في كثافة الخلايا المناعية في بطانة الرحم المحيطة بالزرع في النساء المصابات بجمهورية مقدونيا.
أحد التفسيرات المحتملة لعدم اليقين هو أن تقييم كثافة الخلايا المناعية بطانة الرحم قد يكون صعبا بسبب التغيرات السريعة في بطانة الرحم أثناء نافذة الزرع. خلال الإطار الزمني 24 ساعة, تغييرات كبيرة في بطانة الرحم تغيير كثافة الخلايا المناعية وإفراز السيتوكين, إدخال مصدر الاختلاف في هذه النتائج12. وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد معظم التقارير أساسا على استخدام تلطيخ خلية واحدة (مثل الطرق التقليدية للHHC) التي لا يمكن فحص علامات متعددة على نفس القسم الأنسجة. على الرغم من أن قياس التدفق الخلوي يمكن استخدامه للكشف عن مجموعات خلايا متعددة في عينة واحدة ، إلا أن الكميات الكبيرة من الخلايا المطلوبة والتحسين الذي يستغرق وقتا طويلا يعيق شعبية وكفاءة هذه الطريقة. وبالتالي ، فإن التقدم الأخير في تلطيخ IHC متعددة يمكن أن يحل هذه المشكلة عن طريق وضع علامات متعددة على نفس الشريحة لتقييم معلمات متعددة ، بما في ذلك نسب الخلايا والتوطين النسيجي للتجمعات الفرعية المناعية الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه التكنولوجيا تعظيم المعلومات التي تم الحصول عليها في حالة محدودية توافر الأنسجة. في نهاية المطاف، يمكن أن تساعد هذه التقنية في توضيح الاختلافات في تفاعلات الخلايا المناعية في بطانة الرحم بين النساء الخصبات والنساء المصابات بجمهورية مقدونيا.
وتم تعيين مجموعتين من النساء من مستشفى أمير ويلز، بما في ذلك نساء مراقبة الخصوبة ونساء أجهضن بشكل متكرر غير مبرر. وعرفت السيطرة على الخصوبة بأنها النساء اللاتي أنجبن ولادة حية واحدة على الأقل دون أي تاريخ من الإجهاض التلقائي، وعرفت نساء جمهورية مقدونيا بأنهن أولئك اللاتي سبقهن أن أجهضن ≥2 حالة متتالية قبل الأسبوع العشرين من الحمل. واستوفيت المواد من المجموعتين معايير الإدراج التالية: (أ) العمر بين 20 و 42 سنة، (ب) غير المدخن، (ج) الدورة الشهرية العادية (25-35 يوما) وبنية الرحم العادية، (د) عدم استخدام أي نظام هرموني لمدة 3 أشهر على الأقل قبل خزعة بطانة الرحم، (ه) عدم وجود هيدروسالبينك عن طريق الهستيرو-سالبينجوغرام. وبالإضافة إلى ذلك، كان جميع المواضيع المعينة karyotyping العادي، طبيعي 3 الأبعاد السونوغرافيا الفائقة hysterosalpingogram، اليوم 2 هرمون تحفيز الجريب 30 نانومول / لتر، وظيفة الغدة الدرقية العادية، واختبار سلبي للذئبة المضادة للتخثر ومضادات الإيغ ديسيلبين IgG وIgM.
لفهم أفضل لأساس المناعة من RM، سيكون من المرغوب فيه للغاية لتحديد وترجمة أنواع الخلايا المناعية الرئيسية الموجودة في بطانة الرحم في وقت الزرع في وقت واحد. تصف هذه الورقة البروتوكول بأكمله من إعداد العينة ، وتحسين تعدد المضاعفات مع علامات للأنواع الفرعية للخلايا المناعية ، ومسح الشرائح ، يليه تحليل البيانات مع إشارة محددة إلى الكشف عن الخلايا المناعية بطانة الرحم. وعلاوة على ذلك، تصف هذه الورقة كيفية تحديد كثافة وتتجمع أنواع الخلايا المناعية في وقت واحد في بطانة الرحم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الهامة داخل البروتوكول
من المهم ملاحظة أن تلطيخ متعددة يتطلب التحسين الدؤوب. يتطلب استرجاع المستضد ، باستخدام تقنية التخزين المؤقت والميكروويف ، التحسين لضمان تجريد الأجسام المضادة الكاملة والحفاظ على صلاحية الأنسجة. كما الكواشف TSA ربط بشكل متناقض إلى المواقع المحيطة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الاستئماني لأمراض النساء والتوليد في هونغ كونغ في عام 2018 وصندوق هونغ كونغ للصحة والبحوث الطبية (06170186، 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
