Gemultiplexte fluorescerende immunohistochemische kleuring van vier endometriumimmuunceltypen bij terugkerende miskraam
Summary
Ondanks de vooruitgang in multiplex immunohistochemie en multispectrale beeldvorming, blijft het karakteriseren van de dichtheid en clustering van belangrijke immuuncellen tegelijkertijd in het endometrium een uitdaging. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd multiplexkleuringsprotocol en beeldvorming voor de gelijktijdige lokalisatie van vier immuunceltypen in het endometrium.
Abstract
Immunohistochemie is de meest gebruikte methode voor de identificatie en visualisatie van weefselantigenen in biologisch onderzoek en klinische diagnostiek. Het kan worden gebruikt om verschillende biologische processen of pathologieën te karakteriseren, zoals wondgenezing, immuunrespons, weefselafstoting en weefsel-biomateriaalinteracties. De visualisatie en kwantificering van meerdere antigenen (vooral voor immuuncellen) in een enkele weefselsectie met behulp van conventionele immunohistochemische (IHC) kleuring blijft echter onbevredigend. Vandaar dat de afgelopen jaren multiplextechnologieën zijn geïntroduceerd om meerdere biologische markers te identificeren in een enkel weefselmonster of een ensemble van verschillende weefselmonsters.
Deze technologieën kunnen vooral nuttig zijn bij het differentiëren van de veranderingen in immuuncel-cel-naar-cel interacties binnen het endometrium tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met terugkerende miskramen tijdens implantatie. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor multiplexed fluorescentie IHC-kleuring om de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen tegelijkertijd te onderzoeken in nauwkeurig getimede endometriummonsters tijdens embryo-implantatie. De methode omvat monstervoorbereiding, multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia’s, gevolgd door gegevensanalyse, met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen.
Met behulp van deze methode kunnen de dichtheid en clustering van vier belangrijke immuunceltypen in het endometrium tegelijkertijd worden geanalyseerd in een enkele weefselsectie. Daarnaast zal dit artikel de kritieke factoren en probleemoplossing bespreken om mogelijke fluorofoorinterferentie tussen de fluorescerende sondes die worden toegepast te overwinnen. Belangrijk is dat de resultaten van deze multiplexkleuringstechniek kunnen helpen een diepgaand inzicht te krijgen in de immunologische interactie en regulatie tijdens embryo-implantatie.
Introduction
Terugkerende miskraam (RM) kan worden gedefinieerd als het verlies van twee of meer zwangerschappen vóór 24 weken zwangerschap1. Deze frequente reproductieve aandoening treft tot 1% van de paren wereldwijd2,3. De pathofysiologie is multifactorieel en kan worden onderverdeeld in embryologisch gedreven oorzaken (voornamelijk als gevolg van een abnormaal embryonaal karyotype) en maternale oorzaken die het endometrium en / of placenta-ontwikkeling beïnvloeden. Deze manifestatie kan het gevolg zijn van ouderlijke genetische afwijkingen, baarmoederafwijkingen, protrombotische aandoeningen, endocrinologische factoren en immunologische aandoeningen4.
In de afgelopen jaren is immuuneffectorceldisfunctie betrokken geweest bij de pathogenese van vroeg zwangerschapsverlies5. Dit heeft veel onderzoeken geïnspireerd naar het ophelderen van de specifieke populaties van immuuncellen in het baarmoederslijmvlies tijdens de menstruatiecyclus, implantatie en vroege zwangerschap, met specifieke rollen in de vroege zwangerschap. Onder deze immuuncellen spelen baarmoeder natural killer (uNK) cellen een cruciale rol tijdens embryo-implantatie en zwangerschap, met name in de processen van trofoblastische invasie en angiogenese6. Studies hebben een verhoogde uNK-celdichtheid aangetoond in het endometrium van vrouwen met RM7,8, hoewel deze bevinding niet geassocieerd was met een verhoogd risico op een miskraam9. Dit stimuleerde echter onderzoek naar de dichtheid van andere immuunceltypen (zoals macrofagen, baarmoederdendritische cellen) in het endometrium bij vrouwen met RM10,11. Niettemin blijft het onzeker of er een significante verandering is in de immuunceldichtheid in het peri-implantatie endometrium bij vrouwen met RM.
Een mogelijke verklaring voor de onzekerheid is dat evaluatie van de endometrium immuunceldichtheid moeilijk kan zijn vanwege de snelle veranderingen in het endometrium tijdens het venster van implantatie. Gedurende het tijdsbestek van 24 uur veranderen significante veranderingen in het endometrium de immuunceldichtheid en cytokinecretie, waardoor een bron van variatie in deze resultaten wordt geïntroduceerd12. Bovendien vertrouwen de meeste rapporten voornamelijk op het gebruik van eencellige kleuring (bijv. Traditionele IHC-methoden) die niet meerdere markers op hetzelfde weefselgedeelte konden onderzoeken. Hoewel flowcytometrie kan worden gebruikt voor het detecteren van meerdere celpopulaties in een enkel monster, belemmeren de grote hoeveelheden cellen die nodig zijn en de tijdrovende optimalisatie de populariteit en efficiëntie van deze methode. Vandaar dat de recente vooruitgang in multiplex IHC-kleuring dit probleem zou kunnen oplossen door meerdere markers op dezelfde dia te immunostainen om meerdere parameters te evalueren, waaronder cellijn en histologische lokalisatie van individuele immuunsubpopulaties. Verder kan deze technologie de verkregen informatie maximaliseren in geval van beperkte beschikbaarheid van weefsel. Uiteindelijk kan deze techniek helpen bij het ophelderen van de verschillen in immuuncelinteracties in het baarmoederslijmvlies tussen vruchtbare vrouwen en vrouwen met RM.
Twee groepen vrouwen werden gerekruteerd uit het Prince of Wales Hospital, waaronder vruchtbare controlevrouwen (FC) en vrouwen met onverklaarbare terugkerende miskraam (RM). Vruchtbare controle werd gedefinieerd als vrouwen die ten minste één levende geboorte hadden zonder enige geschiedenis van spontane miskraam, en RM-vrouwen werden gedefinieerd als degenen die een voorgeschiedenis hadden van ≥2 opeenvolgende miskramen vóór 20 weken zwangerschap. De proefpersonen uit de twee groepen voldeden aan de volgende inclusiecriteria: (a) leeftijd tussen 20 en 42 jaar oud, (b) niet-roker, (c) regelmatige menstruatiecyclus (25-35 dagen) en normale baarmoederstructuur, (d) geen gebruik van een hormonaal regime gedurende ten minste 3 maanden vóór de endometriumbiopsie, (e) geen hydrosalpinx door hystero-salpingogram. Bovendien hadden alle gerekruteerde proefpersonen normale karyotypering, normaal 3-dimensionaal echografie hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerend hormoon 30 nmol / L, normale schildklierfunctie en negatief getest op lupus anticoagulantia en anticardiolipine IgG- en IgM-antilichamen.
Om de immunologische basis van RM beter te begrijpen, zou het het meest wenselijk zijn om tegelijkertijd de belangrijkste immuunceltypen die aanwezig zijn in het endometrium op het moment van implantatie te kwantificeren en te lokaliseren. Dit artikel beschrijft het volledige protocol van monstervoorbereiding, de multiplexoptimalisatie met markers voor immuuncelsubtypen en het scannen van de dia’s, gevolgd door gegevensanalyse met specifieke verwijzing naar het detecteren van endometriumimmuuncellen. Bovendien beschrijft dit artikel hoe de dichtheid en clustering van de immuunceltypen tegelijkertijd in het endometrium kunnen worden bepaald.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
Het is belangrijk op te merken dat multiplexkleuring ijverige optimalisatie vereist. Antigeenherstel, met behulp van citraatbuffer- en microgolftechnologie, vereist optimalisatie om volledige antilichaamstripping te garanderen en de levensvatbaarheid van weefsel te behouden. Omdat TSA-reagentia covalent binden aan plaatsen rond het antigeen, kunnen ze mogelijk de binding van een volgend primair antilichaam remmen door sterische belemmering (ook bekend als het “para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund in 2018 en het Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17. Royal College of Obstetricians & Gynaecologists. , (2011).
- King, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).
- Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. Human NK cells in pregnant uterus: why there. American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).
- Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).
- Yang, Y., et al. HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage. Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).
- Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).
- Jasper, M. J., et al. Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy. Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).
- Kopcow, H. D., et al. T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).
- Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. Immunological aspects of implantation and implantation failure. Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).
- Hong, G., et al. Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Zhao, Y., et al. The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).
