Colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata di quattro tipi di cellule immunitarie endometriali in aborto spontaneo ricorrente
Summary
Nonostante i progressi nell’immunoistochimica multiplex e nell’imaging multispettrale, caratterizzare la densità e il raggruppamento delle principali cellule immunitarie contemporaneamente nell’endometrio rimane una sfida. Questo documento descrive un protocollo dettagliato di colorazione multiplex e l’imaging per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell’endometrio.
Abstract
L’immunoistochimica è il metodo più comunemente usato per l’identificazione e la visualizzazione degli antigeni tissutali nella ricerca biologica e nella diagnostica clinica. Può essere utilizzato per caratterizzare vari processi biologici o patologie, come la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, il rigetto dei tessuti e le interazioni tessuto-biomateriale. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione di più antigeni (specialmente per le cellule immunitarie) in una singola sezione di tessuto utilizzando la colorazione immunoistochimica convenzionale (IHC) rimane insoddisfacente. Pertanto, negli ultimi anni sono state introdotte tecnologie multiplexed per identificare più marcatori biologici in un singolo campione di tessuto o in un insieme di diversi campioni di tessuto.
Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per differenziare i cambiamenti nelle interazioni immuno cellula-cellula all’interno dell’endometrio tra donne fertili e donne con aborti ricorrenti durante l’impianto. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la colorazione IHC a fluorescenza multiplexata per studiare la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie contemporaneamente in campioni endometriali temporizzati con precisione durante l’impianto dell’embrione. Il metodo prevede la preparazione del campione, l’ottimizzazione multiplex con marcatori per i sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall’analisi dei dati, con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali.
Utilizzando questo metodo, la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie nell’endometrio possono essere analizzati simultaneamente in una singola sezione di tessuto. Inoltre, questo documento discuterà i fattori critici e la risoluzione dei problemi per superare possibili interferenze fluoroforiche tra le sonde fluorescenti applicate. È importante sottolineare che i risultati di questa tecnica di colorazione multiplex possono aiutare a fornire una comprensione approfondita dell’interazione immunologica e della regolazione durante l’impianto dell’embrione.
Introduction
L’aborto spontaneo ricorrente (RM) può essere definito come la perdita di due o più gravidanze prima delle 24 settimane digestazione 1. Questa condizione riproduttiva frequente colpisce fino all’1% delle coppie in tutto il mondo2,3. La fisiopatologia è multifattoriale e può essere suddivisa in cause embriologicamente guidate (principalmente a causa di un cariotipo embrionale anormale) e cause guidate dalla madre che influenzano lo sviluppo dell’endometrio e / o della placenta. Questa manifestazione può derivare da anomalie genetiche parentali, anomalie uterine, condizioni protrombotiche, fattori endocrinologici e disturbi immunologici4.
Negli ultimi anni, la disfunzione delle cellule effettrici immunitarie è stata implicata nella patogenesi della perdita precoce della gravidanza5. Ciò ha ispirato molte indagini per chiarire le popolazioni specifiche di cellule immunitarie nell’endometrio durante il ciclo mestruale, l’impianto e la gravidanza precoce, con ruoli specifici all’inizio della gravidanza. Tra queste cellule immunitarie, le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale durante l’impianto dell’embrione e la gravidanza, in particolare nei processi di invasione trofoblastica e angiogenesi6. Gli studi hanno dimostrato un aumento della densità delle cellule uNK nell’endometrio delle donne con RM7,8, anche se questo risultato non è stato associato ad un aumentato rischio di aborto spontaneo9. Tuttavia, questo ha stimolato la ricerca valutando la densità di altri tipi di cellule immunitarie (come macrofagi, cellule dendritiche uterine) nell’endometrio nelle donne con RM10,11. Tuttavia, rimane incerto se vi sia un’alterazione significativa della densità delle cellule immunitarie nell’endometrio perimpianto nelle donne con RM.
Una possibile spiegazione per l’incertezza è che la valutazione della densità delle cellule immunitarie endometriali potrebbe essere difficile a causa dei rapidi cambiamenti nell’endometrio durante la finestra di impianto. Durante il lasso di tempo di 24 ore, cambiamenti significativi nell’endometrio alterano la densità delle cellule immunitarie e la secrezione di citochine, introducendo una fonte di variazione in questi risultati12. Inoltre, la maggior parte dei rapporti si basa principalmente sull’uso della colorazione a singola cellula (ad esempio, metodi IHC tradizionali) che non potrebbero esaminare più marcatori sulla stessa sezione di tessuto. Sebbene la citometria a flusso possa essere utilizzata per rilevare più popolazioni cellulari in un singolo campione, le grandi quantità di cellule richieste e l’ottimizzazione dispendiosa in termini di tempo ostacolano la popolarità e l’efficienza di questo metodo. Quindi, il recente progresso nella colorazione IHC multiplex potrebbe risolvere questo problema immunocolorando più marcatori sullo stesso vetrino per valutare più parametri, tra cui il lignaggio cellulare e la localizzazione istologica delle singole sottopopolazioni immunitarie. Inoltre, questa tecnologia può massimizzare le informazioni ottenute in caso di limitata disponibilità di tessuti. In definitiva, questa tecnica può aiutare a chiarire le differenze nelle interazioni delle cellule immunitarie nell’endometrio tra donne fertili e donne con RM.
Due gruppi di donne sono stati reclutati dal Prince of Wales Hospital, tra cui donne fertili di controllo (FC) e donne con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile (RM). Il controllo fertile è stato definito come le donne che hanno avuto almeno un parto vivo senza alcuna storia di aborto spontaneo, e le donne RM sono state definite come quelle che hanno avuto una storia di ≥2 aborti consecutivi prima di 20 settimane di gestazione. I soggetti dei due gruppi soddisfacevano i seguenti criteri di inclusione: (a) età compresa tra 20 e 42 anni, (b) non fumatore, (c) ciclo mestruale regolare (25-35 giorni) e struttura uterina normale, (d) nessun uso di alcun regime ormonale per almeno 3 mesi prima della biopsia endometriale, (e) nessun idrosalpinx mediante istero-salpingogramma. Inoltre, tutti i soggetti reclutati avevano cariotipo normale, isterosalpingogramma ecografico a 3 dimensioni normale, ormone follicolo-stimolante del giorno 2 30 nmol / L, normale funzione tiroidea e risultati negativi per gli anticorpi anticoagulante lupus e anticardiolipinA IgG e IgM.
Per comprendere meglio le basi immunologiche della RM, sarebbe più auspicabile quantificare e localizzare contemporaneamente i principali tipi di cellule immunitarie presenti nell’endometrio al momento dell’impianto. Questo articolo descrive l’intero protocollo dalla preparazione del campione, l’ottimizzazione multiplex con marcatori per sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall’analisi dei dati con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali. Inoltre, questo documento descrive come determinare la densità e il raggruppamento dei tipi di cellule immunitarie contemporaneamente nell’endometrio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici all’interno del protocollo
È importante notare che la colorazione multiplex richiede un’ottimizzazione diligente. Il recupero dell’antigene, utilizzando il tampone citrato e la tecnologia a microonde, richiede l’ottimizzazione per garantire la completa rimozione degli anticorpi e mantenere la vitalità dei tessuti. Poiché i reagenti TSA si legano covalentemente ai siti che circondano l’antigene, possono potenzialmente inibire il legame di un successivo anticorpo primario attraverso …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dall’Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund nel 2018 e dall’Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
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