Coloração imunohistoquímica fluorescente multiplexada de quatro tipos de células imunes endometrial em aborto recorrente
Summary
Apesar dos avanços na imunohistoquímica multiplex e na imagem multiespectral, caracterizar a densidade e o agrupamento das principais células imunes simultaneamente no endométrio continua sendo um desafio. Este artigo descreve um protocolo detalhado de coloração multiplex e imagens para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.
Abstract
A imunohistoquímica é o método mais utilizado para identificação e visualização de antígenos teciduais em pesquisas biológicas e diagnósticos clínicos. Pode ser usado para caracterizar vários processos biológicos ou patologias, como cicatrização de feridas, resposta imune, rejeição tecidual e interações tecido-biomateriais. No entanto, a visualização e quantificação de múltiplos antígenos (especialmente para células imunes) em uma única seção tecidual usando a coloração imunohistoquímica convencional (IHC) permanece insatisfatória. Assim, tecnologias multiplexadas foram introduzidas nos últimos anos para identificar múltiplos marcadores biológicos em uma única amostra de tecido ou um conjunto de diferentes amostras de tecido.
Essas tecnologias podem ser especialmente úteis para diferenciar as mudanças nas interações célula-imune dentro do endométrio entre mulheres férteis e mulheres com abortos recorrentes durante a implantação. Este artigo descreve um protocolo detalhado para coloração de fluorescência multiplexada do IHC para investigar a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes simultaneamente em amostras endometrial precisamente cronometradas durante a implantação de embriões. O método inclui preparação amostral, otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados, com referência específica à detecção de células imunes endometrial.
Usando este método, a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes no endométrio podem ser analisados simultaneamente em uma única seção tecidual. Além disso, este artigo discutirá os fatores críticos e a solução de problemas para superar possíveis interferências fluorforais entre as sondas fluorescentes que estão sendo aplicadas. É importante ressaltar que os resultados desta técnica de coloração multiplex podem ajudar a fornecer uma compreensão aprofundada da interação e regulação imunológica durante a implantação de embriões.
Introduction
Aborto recorrente (RM) pode ser definido como a perda de duas ou mais gestações antes das 24 semanas de gestação1. Esta condição reprodutiva frequente afeta até 1% dos casais em todo o mundo2,3. A fisiopatologia é multifatorial e pode ser dividida em causas embriológicas (principalmente devido a um karyótipo embrionário anormal) e causas maternamente orientadas que afetam o desenvolvimento endométrio e/ou placentário. Essa manifestação pode resultar de anormalidades genéticas parentais, anomalias uterinas, condições protombolíticas, fatores de endocrinologia e distúrbios imunológicos4.
Nos últimos anos, a disfunção celular com efeito imunológico tem sido implicada na patogênese da perda precoce da gravidez5. Isso inspirou muitas investigações sobre a elucidação das populações específicas de células imunes no endométrio durante o ciclo menstrual, implantação e gravidez precoce, com papéis específicos no início da gravidez. Entre essas células imunes, as células assassinas naturais uterinas (uNK) desempenham um papel crítico durante a implantação e gravidez de embriões, particularmente nos processos de invasão trofoblástica e angiogênese6. Estudos têm mostrado um aumento da densidade celular uNK no endométrio de mulheres com RM7,8, embora este achado não tenha sido associado a um risco aumentado de aborto9. No entanto, isso estimulou pesquisas avaliando a densidade de outros tipos de células imunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) no endométrio em mulheres com RM10,11. No entanto, permanece incerto se há uma alteração significativa na densidade das células imunes no endométrio de peri-implantação em mulheres com RM.
Uma possível explicação para a incerteza é que a avaliação da densidade das células imunes endometrial pode ser difícil devido às rápidas mudanças no endométrio durante a janela de implantação. Durante o período de 24 horas, mudanças significativas no endométrio alteram a densidade das células imunes e a secreção de citocinas, introduzindo uma fonte de variação nesses resultados12. Além disso, a maioria dos relatórios depende principalmente do uso de coloração unicelular (por exemplo, métodos tradicionais de IHC) que não puderam examinar vários marcadores na mesma seção tecidual. Embora a citometria de fluxo possa ser usada para detectar múltiplas populações celulares em uma única amostra, as grandes quantidades de células necessárias e a otimização demorada dificultam a popularidade e eficiência deste método. Assim, o recente avanço na coloração multiplex IHC poderia resolver esse problema imunossumando múltiplos marcadores no mesmo slide para avaliar vários parâmetros, incluindo linhagem celular e localização histológica de subpopulações imunomunes individuais. Além disso, essa tecnologia pode maximizar as informações obtidas em caso de disponibilidade limitada de tecidos. Em última análise, essa técnica pode ajudar a elucidar as diferenças nas interações de células imunes no endométrio entre mulheres férteis e mulheres com RM.
Dois grupos de mulheres foram recrutados do Hospital Prince of Wales, incluindo mulheres de controle fértil (FC) e mulheres com aborto recorrente inexplicável (RM). O controle fértil foi definido como mulheres que tiveram pelo menos um parto vivo sem histórico de aborto espontâneo, e as mulheres RM foram definidas como aquelas que tiveram um histórico de abortos consecutivos ≥2 antes das 20 semanas de gestação. Os sujeitos dos dois grupos atenderam aos seguintes critérios de inclusão: (a) idade entre 20 e 42 anos, (b) não fumante, (c) ciclo menstrual regular (25-35 dias) e estrutura uterina normal, (d) não utilização de qualquer regime hormonal por pelo menos 3 meses antes da biópsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por hytero-salpingograma. Além disso, todos os sujeitos recrutados tinham kariotipagem normal, ultrassonografia 3-dimensional normal histerosalpingograma, hormônio estimulante do folículo dia 2 30 nmol/L, função tireoide normal, e testado negativo para lúpus anticoagulante e anticardolipina IgG e IgMbodies.
Para entender melhor a base imunológica da RM, seria mais desejável quantificar e localizar simultaneamente os principais tipos de células imunes presentes no endométrio no momento da implantação. Este artigo descreve todo o protocolo desde a preparação da amostra, a otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados com referência específica à detecção de células imunes endometrial. Além disso, este artigo descreve como determinar a densidade e o agrupamento dos tipos de células imunes simultaneamente no endométrio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do protocolo
É importante notar que a coloração multiplex requer otimização diligente. A recuperação de antígenos, usando a tecnologia de tampão citrato e micro-ondas, requer otimização para garantir a remoção completa de anticorpos e manter a viabilidade do tecido. Como os reagentes da TSA se ligam covalentemente aos locais ao redor do antígeno, eles podem potencialmente inibir a ligação de um anticorpo primário subsequente através de obstáculos estéricos (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Fundo Fiduciário Obstetra e Ginecológico de Hong Kong em 2018 e pelo Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).
Materials
| Amplification Diluent | Perkin Elmer | FP1498 | Fluorophore diluent buffer |
| Antibody diluent | Perkin Elmer | ARD1001EA | Diluting the antibody |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | Primary antibody |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | Primary antibody |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | Primary antibody |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | Primary antibody |
| Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | Antigen retrieval solution |
| EMSURE Xylene (isomeric mixture) | Merck | 108297 | Dewaxing |
| Ethanol absolute | Merck | 107017 | Ethyl alcohol for rehydration |
| HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome | Leica | RM2125RTS | Sectioning of paraffin-embedded tissue |
| inForm Advanced Image Analysis Software | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0) | Data Analysis software |
| Mantra® Workstation | Akoya Biosciences | CLS140089 | Spectral imaging |
| Microwave | Panasonic | Inverter | Microwave stripping |
| Opal 520 | Perkin Elmer | FP1487A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 620 | Perkin Elmer | FP1495A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 650 | Perkin Elmer | FP1496A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | Appropriate tyramide based fluorescent reagent |
| Oven | Memmert | U10 | Dewaxing |
| Peroxidase Blocking Solution | DAKO | S2023 | Removal of tissue peroxidase activities |
| Poly-L-lysine coated slide | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | Slide for routine histological use |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | Mounting |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | Spatial point pattern analysis |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | Nucleic acid staining |
| Tissue Processor | Thermo Fischer | Excelsior ES | Tissue processing for dehydration and paraffination |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | Washing solution |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | Nonionic detergent |
References
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