멀티플렉스 면역히스토케및 다스펙트럼 이미징의 발전에도 불구하고, 자궁내막에서 동시에 주요 면역 세포의 밀도와 군집을 특성화하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 논문은 자궁 내막에서 4개의 면역 세포 모형의 동시 국소화를 위한 상세한 멀티플렉스 염색 프로토콜 및 화상 진찰을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
면역 조직 화학은 생물학적 연구 및 임상 진단에서 조직 항원의 식별 및 시각화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 상처 치유, 면역 반응, 조직 거부 및 조직-생체 물질 상호 작용과 같은 다양한 생물학적 과정 이나 병리를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 종래의 면역조직화학(IHC)을 이용한 단일 조직 섹션에서 다중 항원(특히 면역세포용)의 시각화 및 정량화는 만족스럽지 못한 남아 있다. 따라서, 멀티플렉스 기술은 단일 조직 샘플 또는 상이한 조직 샘플의 앙상블에서 다중 생물학적 마커를 식별하기 위해 최근 몇 년 동안 도입되었다.
이러한 기술은 이식 중 재발성 유산을 가진 비옥한 여자와 여자 사이 내측 내의 면역 세포 세포-세포 상호 작용에 있는 변경을 분화에 특히 유용할 수 있습니다. 이 논문은 배아 이식 중 정확하게 시간조정된 자궁내막 표본에서 4가지 주요 면역 세포 유형의 밀도와 클러스터링을 동시에 조사하기 위해 멀티플렉스 형광 IHC 염색을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 심료 제제, 면역 세포 아류형을 위한 마커를 이용한 멀티플렉스 최적화, 슬라이드의 스캔, 데이터 분석, 자궁내막 면역 세포 검출에 대한 구체적인 참조등이 포함된다.
이 방법을 이용하여, 내측에서 4가지 주요 면역세포 유형의 밀도 및 군집은 단일 조직 섹션에서 동시에 분석될 수 있다. 또한, 이 논문에서는 적용중인 형광 프로브 사이의 가능한 형광 간섭을 극복하기 위한 중요한 요인과 문제 해결에 대해 논의할 것입니다. 중요한 것은, 이 멀티플렉스 염색 기술의 결과는 배아 이식 도중 면역학적 상호 작용 및 조절의 심층적인 이해를 제공하는 것을 도울 수 있습니다.
서론
재발성 유산(RM)은 임신1의24주 전에 2개 이상의 임신을 상실하는 것으로 정의될 수 있다. 이 빈번한 생식 상태는전세계2,3의부부의 1%까지 영향을 미칩니다. 병리학은 다인성이며 배아 중심의 원인 (주로 비정상적인 배아 karyotype으로 인한) 및 내측 및 / 또는 태반 발달에 영향을 미치는 모계 구동 원인으로 나눌 수 있습니다. 이 증상은 부모의 유전적 이상, 자궁 이상, 보혈증 조건, 내분비학 요인 및 면역 장애4에서발생할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 면역 이펙터 세포 기능 장애는 조기 임신손실5의병인에 연루되어 있다. 이것은 생리 주기 도중 자궁 내막에 있는 면역 세포의 특정 인구를 해명하는 많은 조사를 영감을 주었습니다, 이식, 및 초기 임신, 초기 임신에 있는 특정 역할. 이러한 면역 세포 중, 자궁 자연 살인자 (uNK) 세포는 특히 열대 성 침략 및 혈관 신생 의 과정에서, 배아 이식 및 임신 동안 중요한역할을한다 6. 연구 결과는 RM
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프로토콜
연구 결과는 홍콩-새로운 영토 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리 위원회의 합동 중국 대학에 의해 승인되었습니다. 자궁내막생검을 수집하기 전에 참가자들로부터 통보된 동의를 얻었다. 컨트롤 및 RM 그룹의 포함 기준에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.
1. 샘플 준비
- 이 연구의 모든 여성이 월경 주기의 9일째부터 매일 소변 딥스틱 검사를 받아야 배란을 검출하기 위해 황체화 호르몬(LH) 서지를 식별하고, LH 서지(LH+7) 다음7일째에 자궁내막생검을 정확하게 검사합니다.
- 비옥한 여성과 여성의 Pipelle 샘플러 또는 파이프 큐레를 사용하여 자궁내막 생검의 0.5cm2 단편을 획득하십시오.
참고: 고정의 부피는 조직의 5-10 배여야 합니다. - 용융 파라핀 왁스에 내장하기 전에 조직 처리 기계에 탈수카트리지에 조직을 배치합니다. 58-60°C에서 파라핀에 조직을 포함.
- 파라핀 블록을 실온에서 밤새 식힙니다. 마이크로토메를 사용하여 파라핀 블록을 3 μm 두께로 다듬습니다.
참고: 멀티플렉스 염색 을 통해 적절한 조직 마운팅 및 준수에 증류수 보조기구를 사용합니다. - 파라핀 리본을 40-45°C의 수조에 30s에 놓습....
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결과
4개의 자궁내막 면역 세포 모형의 검출을 위한 4색 멀티플렉스 분석능력을 수행하는 전반적인 회로도 과정은 도 1에도시된다. 간단히 말해서, 이 멀티플렉스 면역형광 염색에 대한 프로토콜은 8가지 주요 단계를 필요로 했습니다: 1. 슬라이드 제제, 2. Epitope 검색, 3. 차단, 4. 1 차 항체 응용 프로그램, 5. 이차 항체 응용 프로그램, 6. 신호 증폭, 항체 제거, 및 8. 카운터스테인 및 마운트. 영상 렌더링 및 분석은 인폼 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 생성된 스펙트럼 라이브러리를 이용한 만트라 워크스테이션을 사용하여 실시하여 4가지 면역세포 유형을 내메트리엄샘플(그림 2)에서분화하였다.
4개의 자궁내막 면역 세포 모형은 이 멀티플렉스 염색 기술을 사용하여 인간 내막심 견본에서 규명될 수 있습니다: CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD68+ 대식.......
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토론
프로토콜 내의 중요한 단계
멀티플렉스 염색에는 부지런한 최적화가 필요합니다. 구연산 완충및 마이크로파 기술을 사용하여 항원 회수는 완전한 항체 제거를 보장하고 조직의 생존가능성을 유지하기 위해 최적화가 필요합니다. TSA 시약이 항원을 둘러싼 부위에 공유적으로 결합함에 따라, 그들은 잠재적으로 스테릭 방해를 통해 후속 1 차 항체의 결합을 억제 할 수 있습니다 (또한 "우산 효과"라고도 함). 이것은 다중 면역 마커가 단 하나 세포 구획에 거주하고 불소 로피홀 간섭을 일으키는 원인이 될 때 생기는 경향이 있습니다. 효과가 있을지 여부를 확인하기 위해 면역 세포의 국소화에 중복되는 것을 확인하기 위해 모노플렉스 IHC/IF를 사전에 수행하는 것이 중요합니다. 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위해 단일 샘플 염색이 필요하므로 검증된 스펙트럼 라이브러리는 개별 신호의 차별을 용이하게 하여 형광간섭을 더욱 방지할 수 있습니다. 필요한 경우, 1차 항체 농도 및 배양 시간, 불소-항체 페어링, TSA 플.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 2018년 홍콩 산부인과 신탁 기금과 홍콩 보건 의료 연구 기금(06170186, 07180226)에 의해 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 증폭 희석제 | Perkin Elmer | FP1498 | 형광단 희석 |
| 제 완충액 | Perkin Elmer | ARD1001EA | 항체 희석 |
| CD3 | Spring Bioscience | M3072 | 1차 항체 |
| CD20 | Biocare Medical | CM004B | 1차 항체 |
| CD56 | Leica | NCL-CD56-504 | 1차 항체 항체 |
| CD68 | Spring Bioscience | M5510 | 1차 항체 |
| 구연산염 완충 용액, pH 6.0 (10x) | Abcam | AB64214 | 항원 회수 용액 |
| EMSURE Xylene (이성질체 혼합물) | Merck | 108297 | 탈왁싱 |
| 에탄올 절대 | Merck | 107017 | 수분 보충용 에틸 알코올 |
| HistoCore BIOCUT 수동 로터리 라이카 Microtome | Leica | RM2125RTS | 파라핀 포매 조직 절편 |
| inForm 고급 이미지 분석 소프트웨어 | Perkin Elmer | inForm® Tissue Finder Software 2.2.1 (버전 14.0) | 데이터 분석 소프트웨어 |
| Mantra® 워크스테이션 | Akoya Biosciences | CLS140089 | 분광 이미징 |
| 마이크로파 | 파나소닉 | 인버터 | 마이크로파 스트리핑 |
| 오팔 520 | 퍼킨 엘머 | FP1487A | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| 오팔 620 | 퍼킨 엘머 | FP1495A | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| 오팔 650 | 퍼킨 엘머 | FP1496A | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| Opal 690 | Perkin Elmer | FP1497A | 적절한 티라미드 기반 형광 시약 |
| 오븐 | Memmert | U10 | 탈랍싱 |
| 과산화효소 차단 용액 | DAKO | S2023 | 조직 과산화효소 활성 제거 |
| 폴리-L-라이신 코팅 슬라이드 | FISHER SCIENTIFIC | 120-550-15 | 일상적인 조직학적 사용을 위한 슬라이드 |
| PolyHRP Broad Spectrum | Perkin Elmer | ARH1001EA | Secondary antibody |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | ThemoFisher Scientific | P36930 | 마운팅 |
| Spatstat | / | Version 2.1-0 | 공간 포인트 패턴 분석 |
| Spectral DAPI | Perkin Elmer | FP1490A | 핵산 염색 |
| 조직 처리기 | Thermo Fischer | Excelsior ES | 탈수 및 파라핀화를 위한 조직 처리 |
| Tris Buffer Saline (TBS), 10x | Cell Signaling Technology | 12498S | 세척 용액 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1370-1L | 비이온성 세제 |
참고문헌
- ESHRE Guideline Group on RPL et al. ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss. Human Reproduction Open. 2018 (2), 004(2018).
- Stirrat, G. M. Recurrent miscarriage. Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).
- Rai, R., Regan, L.
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재인쇄 및 허가
