Optogenetisk fase overgang af TDP-43 i Spinal Motor Neuroner af Zebrafish Larver

Summary

Vi beskriver en protokol til at fremkalde fase overgang af TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) af lys i spinal motor neuroner ved hjælp af zebrafisk som model.

Abstract

Unormal protein aggregering og selektiv neuronal sårbarhed er to store kendetegn for neurodegenerative sygdomme. Årsagssammenhænge mellem disse funktioner kan afhøres ved at kontrollere faseovergangen af et sygdomsrelateret protein i en sårbar celletype, selv om denne eksperimentelle tilgang hidtil har været begrænset. Her beskriver vi en protokol, der skal fremkalde faseovergang af RNA/DNA-bindende protein TDP-43 i spinalmotoriske neuroner af zebrafisk larver til modellering af cytoplasmisk sammenlægning af TDP-43, der forekommer i degenererende motoriske neuroner i amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Vi beskriver en bakteriel kunstig kromosom (BAC)-baseret genetisk metode til at levere en optogenetisk TDP-43 variant selektivt til spinal motor neuroner af zebrafisk. Zebrafisk larvernes høje gennemskinnelighed giver mulighed for faseovergang af den optogenetiske TDP-43 i spinalmotorennene ved en simpel ekstern belysning ved hjælp af en lysdiode (LED) mod uhæmmet fisk. Vi præsenterer også en grundlæggende arbejdsgang for levende billeddannelse af zebrafisk spinal motor neuroner og billedanalyse med frit tilgængelige Fiji / ImageJ software til at karakterisere svarene fra optogenetiske TDP-43 til lysbelysning. Denne protokol muliggør karakterisering af TDP-43 faseovergang og aggregeret dannelse i et ALS-sårbart cellulært miljø, hvilket bør lette en undersøgelse af dets cellulære og adfærdsmæssige konsekvenser.

Introduction

Ribonucleoproteingranulatgranulat (RNP) kontrollerer et utal af cellulære aktiviteter i kernen og cytoplasmaet ved at samle membranløse skillevægge via væske-væske faseadskillelse (LLPS), et fænomen, hvor en homogen væske demixes i to forskellige flydende ^faser1,2. De dysregulerede LLPS af RNA-bindende proteiner, der normalt fungerer som RNP granulatkomponenter, fremmer unormal faseovergang, hvilket fører til proteinaggregation. Denne proces har været impliceret i neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative ^{sygdomme3,4,5}. Den præcise vurdering af en årsagssammenhæng mellem afvigende LLPS af RNA-bindende proteiner og sygdomspatogenese er afgørende for at afgøre, om og hvordan LLPS kan udnyttes som et effektivt terapeutisk mål. LLPS af RNA-bindende proteiner er relativt let at studere in vitro og i encellede modeller, men er vanskelig i flercellede organismer, især i hvirveldyr. Et kritisk krav til at analysere sådanne LLPS i individuelle celler i et vævsmiljø er at stikke en sonde til billeddannelse og manipulation af LLPS i en sygdoms-sårbar celle type interesse.

Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en i sidste ende dødelig neurologisk lidelse, hvor motoriske neuroner i hjernen og rygmarven er selektivt og gradvist tabt på grund af degeneration. Til dato har mutationer i mere end 25 gener været forbundet med den arvelige (eller familiære) form af ALS, som tegner sig for 5%-10% af de samlede ALS-tilfælde, og nogle af disse ALS-forårsager gener koder RNA-bindende proteiner bestående af RNPs, såsom hnRNPA1, TDP-43 og ^FUS6,7. Desuden er den sporadiske form af ALS, som tegner sig for 90%-95% af de samlede ALS-tilfælde, karakteriseret ved den cytoplasmatiske sammenlægning af TDP-43 deponeret i degenererende motoriske neuroner. Et vigtigt kendetegn ved disse ALS-associerede RNA-bindende proteiner er deres iboende uordnede regioner (IDR) eller lav kompleksitet domæner, der mangler bestilt tre-dimensionelle strukturer og mægle svage protein-protein interaktioner med mange forskellige proteiner, der driver ^LLPS7,8. Det faktum, at ALS-forårsager mutationer ofte forekommer i de dybdegående har ført til tanken om, at afvigende LLPS og fase overgang af disse ALS-relaterede proteiner kan ligge til grund for ALS patogenese9,10.

For nylig blev optoDroplet-metoden, en Cryptochrome 2-baseret optogenetisk teknik, der gør det muligt at modulere proteinproteininteraktioner ved lys, udviklet for at fremkalde faseovergang af proteiner med ^IDR11. Da denne teknik er blevet udvidet med succes til TDP-43, er den begyndt at afdække de mekanismer, der ligger til grund for den patologiske faseovergang af TDP-43 og den tilhørende cytotoksicitet12,13,14,15. I denne protokol skitserer vi en genetisk metode til at levere en optogenetisk TDP-43 til ALS-sårbare celletyper, nemlig spinal motor neuroner i zebrafisk ved hjælp af BAC til mnr2b/mnx2b genet, der kodning et homeodomainprotein til motor neuronspecifikation16,17. Zebrafisk larvernes høje gennemskinnelighed giver mulighed for enkel, ikke-invasiv lysstimulering af den optogenetiske TDP-43, der udløser dens faseovergang i spinalmotorennenene. Vi præsenterer også en grundlæggende arbejdsgang for levende billeddannelse af zebrafisk spinal motor neuroner og billedanalyse ved hjælp af frit tilgængelige Fiji / ImageJ software til at karakterisere svarene fra optogenetiske TDP-43 til lysstimulering. Disse metoder giver mulighed for en undersøgelse af TDP-43 fase overgang i en ALS-sårbare cellulære miljø og bør bidrage til at udforske dens patologiske konsekvenser på cellulære og adfærdsmæssige niveauer.

Protocol

Alt fiskearbejde blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr i udvalget for institutionel dyrepleje og -anvendelse (godkendelsesidentifikationsnummer 24-2) fra National Institute of Genetics (Japan), som har en dyrevelfærdsforsikring på filen (sikringsnummer A5561-01) ved Kontoret for Laboratorie dyrevelfærd ved National Institutes of Health (NIH, USA). 1. Opførelse af TAC’er til udtryk for optogenetisk TDP-43 gen fra mnr2b promotor<…

Representative Results

Live imaging af optogenetiske og ikke-optogenetiske TDP-43 proteiner i mnr2b + spinal motor neuroner af zebrafisk larverFor at fremkalde TDP-43 fase overgang i spinal motor neuroner i zebrafisk, en menneskelig TDP-43h, der er mærket med mRFP1 og CRY2olig22 på N- og C-termini, henholdsvis blev konstrueret og udpeget som opTDP-43h14 (Figur 1A). OpTDP-43h-genfragmentet blev indført…

Discussion

Den mnr2b-BAC-medieret udtryk for opTDP-43h og EGFP-TDP-43z i zebrafisk giver en unik mulighed for levende billeddannelse af TDP-43 fase overgang i spinal motor neuroner. Den optiske gennemsigtighed af kropsvæv af zebrafisk larver giver mulighed for enkel og ikke-invasiv optogenetisk stimulering af opTDP-43h. Sammenligninger mellem enkelt spinal motor neuroner over tid viste, at den lysafhængige oligomerisering af opTDP-43h forårsager sin cytoplasmaiske klyngedannelse, som minder om ALS patologi.

<p class…

Materials

Confocal microscope	Olympus	FV1200
Epifluorescence microscope	ZEISS	Axioimager Z1
Fluorescence stereomicroscope	Leica	MZ16FA
Glass base dish	IWAKI	3910-035
Incubator	MEE	CN-25C
LED panel	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plus	TAKARA	AD110
NucleoBond BAC100	MACHEREY-NAGEL	740579
NuSieve GTG Agarose	LONZA	50181
Objective lens	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
Objective lens	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
Optical power meter	HIOKI	3664
Optical sensor	HIOKI	9742-10
Phenol red solution 0.5%	Merck	P0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase	TAKARA	R050A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Six-well dish	FALCON	353046
Spectrometer probe BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
Syringe needle	TERUMO	NN-2725R
TaKaRa Ex Taq	TAKARA	RR001A
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16	BACPAC Genomics	CH211-172N16