얼룩말 물고기 애벌레의 척추 모터 뉴런에서 TDP-43의 광유전학 적 단계 전환
Summary
우리는 제브라피시를 모델로 사용하여 척추 운동 뉴런의 빛에 의한 TAR DNA 결합 단백질(43)의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
비정상적인 단백질 집계 및 선택적 뉴런 취약성은 신경 퇴행성 질환의 두 가지 주요 특징입니다. 이러한 특징 들 사이의 인과 관계는 취약한 세포 유형에서 질병 관련 단백질의 위상 전이를 제어함으로써 심문 될 수 있지만, 이러한 실험적 접근방식은 지금까지 제한되었습니다. 여기서, 근위축성 측삭 경화증(ALS)에서 퇴행성 모터 뉴런에서 발생하는 TDP-43의 세포질 응집 모델링을 위한 제브라피시 애벌레의 척추 운동 뉴런에서 RNA/DNA 결합 단백질 TDP-43의 위상 전이를 유도하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 선택적으로 광유전학 TDP-43 변종을 전달하는 세균성 인공 염색체 (BAC)기지를 둔 유전 방법을 기술합니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 억제되지 않은 물고기에 대한 발광 다이오드(LED)를 사용하여 간단한 외부 조명에 의해 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43의 위상 전환을 허용합니다. 우리는 또한 광 조명에 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어와 함께 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징의 기본 워크플로우를 제시한다. 이 프로토콜은 ALS 취약 세포 환경에서 TDP-43 위상 전환 및 집계 형성의 특성화를 가능하게 하며, 이는 세포 및 행동 결과에 대한 조사를 용이하게 해야 합니다.
Introduction
리보뉴클레오단백질(RNP) 과립은 균질유체가 2개의 뚜렷한 액체 상1,2로 분해되는 현상인 액체 액체 상 분리(LLPS)를 통해 멤브레인 이없는 분할을 조립하여 핵 및 세포질에서 무수한 세포 활동을 제어합니다. RNP 과립 성분으로 일반적으로 작동하는 RNA 결합 단백질의 소화 불량 LLPS는 단백질 응집으로 이끌어 내는 이상한 상 전이를 촉진합니다. 이 과정은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환에 연루되었습니다3,4,5. RNA 결합 단백질과 질병 병인의 비정상적인 LLPS 사이의 인과 관계의 정확한 평가는 LLPS가 효과적인 치료 대상으로 악용 될 수있는 여부와 방법을 결정하기위해 중요합니다. RNA 결합 단백질의 LLPS는 시험관 내 및 단세포 모형에서 공부하기 쉽지만 다세포 유기체, 특히 척추동물에서는 어렵습니다. 조직 환경 내의 개별 세포에서 이러한 LLPS를 분석하기 위한 중요한 요구 사항은 질병에 취약한 세포 유형의 LLPS의 이미징 및 조작을 위한 프로브를 안정적으로 표현하는 것입니다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 뇌와 척수의 운동 뉴런이 변성으로 인해 선택적으로 점진적으로 손실되는 궁극적으로 치명적인 신경 장애입니다. 현재까지 25개 이상의 유전자에 있는 돌연변이는 총 ALS 케이스의 5%-10%를 차지하는 유전성(또는 가족적인) 형태의 ALS와 연관되어 있으며, 이들 ALS 유발 유전자 중 일부는 hnRNPA1, TDP-43 및 FUS6,7과 같은 RNP로 구성된 RNA 결합 단백질을 인코딩합니다. 더욱이, 총 ALS 케이스의 90%-95%를 차지하는 ALS의 산발적인 양식은 퇴행성 운동 뉴런에 증착된 TDP-43의 세포질 집계를 특징으로 합니다. 이러한 ALS 관련 RNA 결합 단백질의 주요 특징은 본질적으로 무질서한 영역(IDRs) 또는 주문된 3차원 구조가 부족한 저복잡성 영역이며 LLPS7,8을 구동하는 많은 다른 단백질과 약한 단백질 단백질 상호 작용을 중재합니다. ALS 일으키는 돌연변이가 IDRs에서 수시로 생기는 다는 사실은 이 ALS 관련 단백질의 비정상적인 LLPS 및 위상 전이가 ALS 병인9,10의 기초가 될 수 있다는 생각으로 이끌어 냈습니다.
최근에는 광에 의한 단백질-단백질 상호작용을 조절할 수 있는 Cryptochrome 2기반 광유전학기인 OptoDroplet 방법이 IDRs11을 이용한 단백질의 위상 전이를 유도하기 위해 개발되었다. 이 기술은 TDP-43로 성공적으로 확장되었기 때문에 TDP-43의 병리학적 위상 전환과 그 관련 세포 독성12,13,14,15의 기전을 밝히기 시작했습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 ALS 취약 세포 모형, 즉, mnr2b/mnx2b 유전자를 위한 BAC를 사용하여 제브라피시의 척추 운동 뉴런에 광유전학 TDP-43을 전달하는 유전 적 방법을 간략하게 설명합니다16,17. 제브라피시 애벌레의 높은 투명도는 척추 운동 뉴런의 위상 전환을 유발하는 광유전학 TDP-43의 간단하고 비침습적인 빛 자극을 허용합니다. 우리는 또한 광 자극에 대한 광유전학 TDP-43의 반응을 특성화하기 위해 자유롭게 사용할 수있는 피지 / ImageJ 소프트웨어를 사용하여 제브라피쉬 척추 운동 뉴런및 이미지 분석의 라이브 이미징을위한 기본 워크플로우를 제시합니다. 이러한 방법은 ALS 취약 한 세포 환경에서 TDP-43 단계 전이의 조사를 허용 하 고 세포 및 행동 수준에서 그것의 병적인 결과 탐구 하는 데 도움이 되어야 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
mnr2b-BAC-매개 발현은 제브라피시의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z의 발현을 척추 운동 뉴런에서 TDP-43 위상 전이의 라이브 이미징을 위한 독특한 기회를 제공한다. 제브라피시 애벌레의 신체 조직의 광학적 투명성은 opTDP-43h의 간단하고 비침습적 광유전학적 자극을 허용합니다. 시간이 지남에 따라 단일 척추 운동 뉴런 사이의 비교는 opTDP-43h의 빛 의존 올리고머화가 ALS 병리학을 연상시키는 세포질 클?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 세리카 펀드 (KA), KAKENHI 그랜트 번호 JP19K06933 (KA) 및 JP20H05345 (KA)에 의해 지원되었다.
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
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