Оптогенетический фазовый переход TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах личинок рыбок данио
Summary
Мы описываем протокол для индуцирования фазового перехода TAR-ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) светом в спинальных двигательных нейронах, используя рыбок данио в качестве модели.
Abstract
Аномальная агрегация белка и селективная уязвимость нейронов являются двумя основными признаками нейродегенеративных заболеваний. Причинно-следственные связи между этими признаками могут быть изучены путем контроля фазового перехода белка, связанного с заболеванием, в уязвимом типе клеток, хотя этот экспериментальный подход до сих пор был ограничен. Здесь мы описываем протокол индуцирования фазового перехода РНК/ДНК-связывающего белка TDP-43 в спинальных двигательных нейронах личинок рыбок данио для моделирования цитоплазматической агрегации TDP-43, происходящей в дегенерирующих двигательных нейронах при боковом амиотрофическом склерозе (БАС). Мы описываем генетический метод на основе бактериальной искусственной хромосомы (BAC) для выборочной доставки оптогенетического варианта TDP-43 к спинальным двигательным нейронам рыбок данио. Высокая прозрачность личинок рыбок данио позволяет осуществлять фазовый переход оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах простым внешним освещением с использованием светодиода (LED) против несдержанных рыб. Мы также представляем базовый рабочий процесс визуализации спинальных двигательных нейронов рыбок данио и анализа изображений с помощью свободно доступного программного обеспечения Fiji / ImageJ для характеристики реакций оптогенетического TDP-43 на световое освещение. Этот протокол позволяет характеризовать фазовый переход TDP-43 и образование агрегатов в уязвимой к БАС клеточной среде, что должно облегчить исследование его клеточных и поведенческих последствий.
Introduction
Гранулы рибонуклеопротеина (RNP) контролируют множество клеточных активностей в ядре и цитоплазме, собирая безмембранные перегородки посредством разделения жидкой и жидкой фазы (LLPS), явление, при котором однородная жидкость демиксирует в две различные жидкие фазы1,2. Дисрегулируемые LLPS РНК-связывающих белков, которые обычно функционируют как гранулярные компоненты RNP, способствуют аномальному фазовому переходу, что приводит к агрегации белка. Этот процесс был вовлечен в нейроразвитие и нейродегенеративные заболевания3,4,5. Точная оценка причинно-следственной связи между аберрантными LLPS РНК-связывающих белков и патогенезом заболевания имеет решающее значение для определения того, можно ли и как LLPS использовать в качестве эффективной терапевтической мишени. LLPS РНК-связывающих белков относительно легко изучать in vitro и в одноклеточных моделях, но трудно в многоклеточных организмах, особенно у позвоночных. Критическим требованием для анализа таких LLPS в отдельных клетках в тканевой среде является стабильная экспрессия зонда для визуализации и манипулирования LLPS в уязвимом к заболеванию типе клеток.
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является в конечном счете смертельным неврологическим расстройством, при котором двигательные нейроны головного и спинного мозга избирательно и постепенно теряются из-за дегенерации. На сегодняшний день мутации в более чем 25 генах были связаны с наследственной (или семейной) формой БАС, на которую приходится 5%-10% от общего числа случаев БАС, и некоторые из этих генов, вызывающих БАС, кодируют РНК-связывающие белки, состоящие из РНК, такие как hnRNPA1, TDP-43 и FUS6,7. Более того, спорадическая форма БАС, на которую приходится 90%-95% от общего числа случаев БАС, характеризуется цитоплазматической агрегацией TDP-43, депонированного в дегенеративных двигательных нейронах. Основной характеристикой этих ALS-ассоциированных РНК-связывающих белков является их внутренне неупорядоченные области (IDR) или домены низкой сложности, которые не имеют упорядоченных трехмерных структур и опосредуют слабые белково-белковые взаимодействия со многими различными белками, которые управляют LLPS7,8. Тот факт, что бас-вызывающие мутации часто встречаются в IDR, привел к идее, что аберрантный LLPS и фазовый переход этих связанных с ALS белков могут лежать в основе патогенеза ALS9,10.
Недавно был разработан метод optoDroplet, оптогенетический метод на основе Cryptochrome 2, который позволяет модулировать белково-белковые взаимодействия светом, чтобы индуцировать фазовый переход белков с помощью IDR11. Поскольку этот метод был успешно распространен на TDP-43, он начал раскрывать механизмы, лежащие в основе патологического фазового перехода TDP-43 и связанной с ним цитотоксичности12,13,14,15. В этом протоколе мы описываем генетический метод доставки оптогенетического TDP-43 к ALS-уязвимым типам клеток, а именно спинальным моторным нейронам у рыбок данио с использованием BAC для гена mnr2b / mnx2b, кодирующего гомеодоменный белок для спецификации двигательных нейронов16,17. Высокая прозрачность личинок рыбок данио позволяет проводить простую, неинвазивную световую стимуляцию оптогенетического TDP-43, который запускает его фазовый переход в спинномозговых двигательных нейронах. Мы также представляем базовый рабочий процесс для визуализации спинальных двигательных нейронов рыбок данио и анализа изображений с использованием свободно доступного программного обеспечения Fiji / ImageJ для характеристики реакций оптогенетического TDP-43 на световую стимуляцию. Эти методы позволяют исследовать фазовый переход TDP-43 в уязвимой к БАС клеточной среде и должны помочь изучить его патологические последствия на клеточном и поведенческом уровнях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mnr2b-BAC-опосредованная экспрессия opTDP-43h и EGFP-TDP-43z у рыбок данио предоставляет уникальную возможность для живой визуализации фазового перехода TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах. Оптическая прозрачность тканей тела личинок рыбок данио позволяет проводить простую и неинваз?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant Numbers JP19K06933 (KA) и JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. 발생학. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
