Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi
Summary
TAR DNA bağlayıcı protein 43’ün (TDP-43) zebra balıklarını model olarak kullanarak spinal motor nöronlarda ışıkla faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Anormal protein toplama ve seçici nöronal kırılganlık nörodejeneratif hastalıkların iki önemli özelliğidir. Bu deneysel yaklaşım şimdiye kadar sınırlı olmasına rağmen, bu özellikler arasındaki nedensel ilişkiler, hastalıkla ilişkili bir proteinin savunmasız bir hücre tipinde faz geçişini kontrol ederek sorgulanabilir. Burada, amyotrofik lateral sklerozda (ALS) dejenere motor nöronlarda meydana gelen TDP-43’ün sitoplazmik toplamasının modellenmesi için zebra balığı larvalarının spinal motor nöronlarında RNA/DNA bağlayıcı protein TDP-43’ün faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz. Zebra balıklarının spinal motor nöronlarına seçici olarak optogenetik bir TDP-43 varyantı sunmak için bakteriyel yapay kromozom (BAC) tabanlı bir genetik yöntem tarif ediyoruz. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, spinal motor nöronlarındaki optogenetik TDP-43’ün, sınırsız balıklara karşı ışık yayan bir diyot (LED) kullanarak basit bir dış aydınlatma ile faz geçişine izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43’ün ışık aydınlatmasına verdiği tepkileri karakterize etmek için zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntüleme ve görüntü analizinin temel bir iş akışını serbestçe kullanılabilen Fiji /ImageJ yazılımı ile sunuyoruz. Bu protokol, ALS’ye karşı savunmasız bir hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin ve agrega oluşumunun karakterize edilmesine olanak tanır ve bu da hücresel ve davranışsal sonuçlarının araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.
Introduction
Ribonikleoprotein (RNP) granülleri, homojen bir sıvının iki ayrı sıvı fazına dönüştüğü bir fenomen olan sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) yoluyla membransız bölümleri birleştirerek çekirdek ve sitoplazmadaki sayısız hücresel aktiviteyi kontrol eder1,2. Normalde RNP granül bileşenleri olarak işlev görür rna bağlayıcı proteinlerin düzensiz LLPS’si anormal faz geçişini teşvik eder ve protein toplanmasına yol ederim. Bu süreç nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara bulaşmıştır3,4,5. RNA bağlayıcı proteinlerin sapkın LLPS’si ile hastalık patogenezinin nedensel ilişkisinin kesin olarak değerlendirilmesi, LLPS’nin etkili bir terapötik hedef olarak kullanılıp kullanılmayacağını ve nasıl kullanılabileceğini belirlemek için çok önemlidir. RNA bağlayıcı proteinlerin LLPS’lerinin in vitro ve tek hücreli modellerde çalışması nispeten kolaydır, ancak özellikle omurgalılarda çok hücreli organizmalarda zordur. Bu tür LLPS’leri doku ortamındaki bireysel hücrelerde analiz etmek için kritik bir gereklilik, hastalık açısından savunmasız bir hücre türünde LLPS’nin görüntülenmesi ve manipülasyonu için bir probun kesin olarak ifade etmesidir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin ve omuriliğin motor nöronlarının dejenerasyon nedeniyle seçici ve aşamalı olarak kaybolduğu sonuçta ölümcül bir nörolojik bozukluktur. Bugüne kadar, 25’ten fazla gendeki mutasyonlar, toplam ALS vakalarının% 5-10’unu oluşturan ALS’nin kalıtsal (veya ailesel) formu ile ilişkilendirilmiştir ve bu ALS nedenli genlerden bazıları hnRNPA1, TDP-43 ve FUS6,7 gibi RNP’lerden oluşan RNA bağlayıcı proteinleri kodlamaktadır. Ayrıca, toplam ALS vakalarının% 90-95’ini oluşturan ALS’nin sporadik formu, dejenere motor nöronlarda biriken TDP-43’ün sitoplazmik toplanması ile karakterizedir. Bu ALS ilişkili RNA bağlayıcı proteinlerin önemli bir özelliği, sıralı üç boyutlu yapılardan yoksun ve LLPS7,8’i yönlendiren birçok farklı proteinle zayıf protein-protein etkileşimlerine aracılık eden özünde düzensiz bölgeleri (IDR’ler) veya düşük karmaşıklık alan adlarıdır. ALS’ye neden olan mutasyonların genellikle IDR’lerde meydana gelmesi, ALS ile ilişkili bu proteinlerin anormal LLPS ve faz geçişinin ALS patogenezinin altında yatan olabileceği fikrine yol açmıştır9,10.
Son zamanlarda, protein-protein etkileşimlerinin ışıkla modülasyonunu sağlayan Cryptochrome 2 tabanlı bir optogenetik teknik olan optoDroplet yöntemi, proteinlerin IDRs11 ile faz geçişini teşvik etmek için geliştirilmiştir. Bu teknik başarıyla TDP-43’e genişletildikçe, TDP-43’ün patolojik faz geçişinin altında kalan mekanizmaları ve buna bağlı sitotoksikliğini ortaya çıkarmaya başlamıştır12,13,14,15. Bu protokolde, ALS’ye karşı savunmasız hücre tiplerine optogenetik bir TDP-43, yani motor nöron spesifikasyonu için bir homeodomain proteinini kodlayan mnr2b/mnx2b gen kodlaması için BAC kullanan zebra balıklarındaki spinal motor nöronları sunmak için genetik bir yöntem özetliyoruz16,17. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, omurilik motoru nöronlarında faz geçişini tetikleyen optogenetik TDP-43’ün basit, noninvaziv ışık stimülasyonuna izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43’ün ışık stimülasyonuna verdiği tepkileri karakterize etmek için serbestçe kullanılabilen Fiji/ImageJ yazılımını kullanarak zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntülenmesi ve görüntü analizi için temel bir iş akışı sunuyoruz. Bu yöntemler, ALS’ye açık hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin araştırılmasına izin verir ve patolojik sonuçlarını hücresel ve davranışsal düzeyde keşfetmeye yardımcı olmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balıklarında opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z’nin mnr2b-BAC aracılı ifadesi, spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişinin canlı görüntülenmesi için eşsiz bir fırsat sağlar. Zebra balığı larvalarının vücut dokularının optik şeffaflığı, opTDP-43h’nin basit ve noninvaziv optogenetik stimülasyonuna izin verir. Zaman içinde tek spinal motor nöronlar arasındaki karşılaştırmalar, opTDP-43h’nin ışığa bağımlı oligomerizasyonunun ALS patolojisini andıran sitoplazmik kümelenmes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numaraları JP19K06933 (KA) ve JP20H05345 (KA) tarafından desteklendi.
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
References
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).
- Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).
- Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders. Cell. 154 (4), 727-736 (2013).
- Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. ALS genes in the genomic era and their implications for FTD. Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).
- Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).
- Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).
- Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).
- Shin, Y., et al. Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets. Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).
- Zhang, P., et al. Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology. Elife. 8, 39578 (2019).
- Mann, J. R., et al. RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43. Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).
- Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons. Nature Communications. 11 (1), 1004 (2020).
- Otte, C. G., et al. Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo. Neurobiology of Disease. 146, 105078 (2020).
- Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation. 발생학. 268 (2), 372-383 (2004).
- Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics. Neural Development. 7, 35 (2012).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Research. 33 (4), 36 (2005).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 100 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nature Communications. 5, 4925 (2014).
- Asakawa, K., Kawakami, K. Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus. Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).
- Redchuk, T. A., et al. Optogenetic regulation of endogenous proteins. Nature Communications. 11 (1), 605 (2020).
