Измерение поглощения глюкозы в моделях дрозофилы протеинопатии TDP-43
Summary
Поглощение глюкозы увеличивается в моторных нейронах Drosophila, пораженных протеинопатией белка, связывающего ДНК(TDP-43), о чем свидетельствует генетически закодированный датчик глюкозы на основе FRET.
Abstract
Боковой амиотрофический склероз является нейродегенеративным расстройством, вызывающим прогрессирующую мышечную слабость и смерть в течение 2-5 лет после постановки диагноза. Клинические проявления включают потерю веса, дислипидемию и гиперметаболизм; однако остается неясным, как они связаны с дегенерацией двигательных нейронов. Используя модель дрозофилы протеинопатии TDP-43, которая повторяет несколько особенностей БАС, включая цитоплазматические включения, двигательную дисфункцию и снижение продолжительности жизни, мы недавно выявили широкий спектр метаболических дефицитов. Среди них было обнаружено, что гликолиз регулируется, и эксперименты с генетическим взаимодействием предоставили доказательства компенсаторного нейропротекторного механизма. Действительно, несмотря на повышение регуляции фосфофруктокиназы, ограничивающего скорость фермента при гликолизе, было показано, что увеличение гликолиза с использованием диетических и генетических манипуляций смягчает двигательную дисфункцию и увеличивает продолжительность жизни в моделях протеинопатии TDP-43. Для дальнейшего изучения влияния протеинопатии TDP-43 на гликолитический поток в двигательных нейронах был использован ранее зарегистрированный генетически закодированный датчик на основе FRET FLII12Pglu-700μδ6. Этот датчик состоит из бактериального глюкозочувствительного домена и голубых и желтых флуоресцентных белков в качестве пары FRET. При связывании глюкозы датчик претерпевает конформационное изменение, позволяющее возникать FRET. Используя FLII12Pglu-700μδ6, было обнаружено, что поглощение глюкозы значительно увеличивается в двигательных нейронах, экспрессирующих TDP-43G298S,вариант, вызывающий БАС. Здесь мы покажем, как измерить поглощение глюкозы, ex vivo,в препаратах личиночного вентрального нервного канатика, экспрессирующих датчик глюкозы FLII12Pglu-700μδ6 в контексте протеинопатии TDP-43. Этот подход может быть использован для измерения поглощения глюкозы и оценки гликолитического потока в различных типах клеток или в контексте различных мутаций, вызывающих БАС и связанные с ним нейродегенеративные расстройства.
Introduction
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является прогрессирующим нейродегенеративным расстройством, которое в настоящее время неизлечимо. БАС поражает верхние и нижние двигательные нейроны, что приводит к потере двигательной координации, необратимому параличу, дыхательной недостаточности и возможной смерти в течение 2-5 лет после постановки диагноза1. БАС связан с метаболическими дефектами, такими как потеря веса, дислипидемия и гиперметаболизм (рассмотрено в2); однако остается неясным, как эти изменения в метаболизме связаны с дегенерацией двигательных нейронов. Общим знаменателем при БАС и связанных с ним нейродегенеративных заболеваниях является TDP-43, белок, связывающий нуклеиновые кислоты, участвующий в нескольких стадиях обработки РНК3,4,5. Хотя мутации в TDP-43 затрагивают только 3-5% пациентов, белок TDP-43 дикого типа обнаруживается в цитоплазматических агрегатах в >97% случаев БАС (рассмотрен в6). Эта патология была смоделирована у дрозофилы путем сверхэкспрессии человеческого дикого типа или мутантного TDP-43 (G298S) в двигательных нейронах, который рекапитулирует множественные аспекты БАС, включая цитоплазматические включения, двигательную дисфункцию и снижение продолжительности жизни7,8. Используя эти модели, недавно сообщалось, что протеинопатия TDP-43 вызывает значительное повышение уровня пирувата и мРНК фосфофруктокиназы (PFK), ограничивающего скорость фермента гликолиза9. Аналогичное увеличение транскриптов PFK было обнаружено в производных от пациента двигательных нейронах и спинном мозге, что свидетельствует о том, что гликолиз повышается в контексте протеинопатии TDP-43. Интересно, что дальнейшее увеличение гликолиза с использованием диетических и генетических манипуляций смягчило несколько фенотипов БАС, таких как двигательная дисфункция и увеличение продолжительности жизни в моделях протеинопатии TDP-43, что согласуется с компенсаторным, нейропротекторным механизмом в дегенерирующих двигательных нейронах.
Для дальнейшего исследования изменений в гликолизе и измерения поглощения глюкозы в моделях дрозофилы протеинопатии TDP-43 ранее зарегистрированный генетически закодированный датчик на основе FRET FLII12Pglu-700μδ610 был экспрессирован в двигательных нейронах, специально используя систему экспрессии UAS-GAL4. Датчик глюкозы FLII12Pglu-700μδ6 использует резонансный перенос энергии между двумя вариантами зеленого флуоресцентного белка, голубых и желтых флуоресцентных белков (CFP и YFP) для обнаружения глюкозы на клеточном уровне. Он состоит из бактериального глюкозосвязывающего домена из гена E. coli MglB, слитого с CFP и YFP на противоположных концах молекулы. При связывании с молекулой глюкозы датчик претерпевает конформационное изменение, сближающее CFP и YFP и позволяющее возникать FRET, которое затем может быть использовано для количественной оценки внутриклеточных уровней глюкозы10,11,12 (рисунок 1). Здесь мы покажем, как датчик FLII12Pglu-700μδ6 может быть использован для определения изменений в поглощении глюкозы, вызванных протеинопатией TDP-43 в двигательных нейронах. Эксперименты, описанные здесь, показывают, что сверхэкспрессия мутанта, связанного с БАС, TDP-43G298S,в двигательных нейронах вызывает значительное увеличение поглощения глюкозы по сравнению с контрольной группой. Этот подход может быть использован в других типах БАС (например, SOD1, C9orf72 и т.д.) и/или других типах клеток (например, глия, мышцы) для определения изменений в поглощении глюкозы, связанных с нейродегенерацией.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, подробно описанный здесь, может быть применен для измерения поглощения глюкозы в определенном типе клеток, представляющих интерес для живой дрозофилы, с использованием FLII12Pglu-700μδ6, датчика на основе FRET, который может обнаруживать изменения уровня глюкозы в миллимолярном?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Стефани Ширмайер и Такеши Ивацубо за предоставление штаммов дрозофилы. Мы также благодарим Патрисию Янсму за помощь в визуализации в Marley Imaging Core в Университете Аризоны. Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения NIH NS091299, NS115514 (для DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (для EM) и Программой исследований биологии бакалавриата (для HB).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
References
- Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).
- Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).
- Buratti, E., Baralle, F. E. Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).
- Polymenidou, M., et al. Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).
- Tollervey, J. R., et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43. Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Estes, P. S., et al. Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS. Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).
- Estes, P. S., et al. Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).
- Manzo, E., et al. Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS. eLife. 8, 45114 (2019).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).
- Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- Ihara, R., et al. RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy. Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).
