Medición de la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía por TDP-43
Summary
La absorción de glucosa aumenta en las neuronas motoras de Drosophila afectadas por la proteinopatía de unión al ADN TAR (TDP-43), según lo indicado por un sensor de glucosa codificado genéticamente basado en FRET.
Abstract
La esclerosis lateral amiotrófica es un trastorno neurodegenerativo que causa debilidad muscular progresiva y muerte dentro de los 2-5 años posteriores al diagnóstico. Las manifestaciones clínicas incluyen pérdida de peso, dislipidemia e hipermetabolismo; sin embargo, no está claro cómo se relacionan con la degeneración de las neuronas motoras. Utilizando un modelo de Drosophila de proteinopatía TDP-43 que recapitula varias características de la ELA, incluidas las inclusiones citoplasmáticas, la disfunción locomotora y la reducción de la vida útil, recientemente identificamos déficits metabólicos de amplio alcance. Entre estos, se encontró que la glucólisis estaba regulada al alza y los experimentos de interacción genética proporcionaron evidencia de un mecanismo neuroprotector compensatorio. De hecho, a pesar de la regulación al alza de la fosfofructoquinasa, la enzima limitante de la velocidad en la glucólisis, se demostró que un aumento en la glucólisis mediante manipulaciones dietéticas y genéticas mitiga la disfunción locomotora y aumenta la vida útil en modelos de mosca de la proteinopatía TDP-43. Para investigar más a fondo el efecto de la proteinopatía TDP-43 sobre el flujo glicolítico en las neuronas motoras, se utilizó un sensor basado en FRET codificado genéticamente previamente, FLII12Pglu-700μδ6. Este sensor está compuesto por un dominio bacteriano sensible a la glucosa y proteínas fluorescentes cian y amarillas como el par FRET. Tras la unión a la glucosa, el sensor sufre un cambio conformacional que permite que se produzca FRET. Usando FLII12Pglu-700μδ6, se encontró que la absorción de glucosa aumentaba significativamente en las neuronas motoras que expresan TDP-43G298S,una variante causante de ELA. Aquí, mostramos cómo medir la absorción de glucosa, ex vivo,en preparaciones larvales del cordón nervioso ventral que expresan el sensor de glucosa FLII12Pglu-700μδ6 en el contexto de la proteinopatía TDP-43. Este enfoque se puede utilizar para medir la absorción de glucosa y evaluar el flujo glucolítico en diferentes tipos de células o en el contexto de diversas mutaciones que causan ELA y trastornos neurodegenerativos relacionados.
Introduction
La Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es un trastorno neurodegenerativo progresivo que actualmente es incurable. La ELA afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores, lo que lleva a la pérdida de la coordinación motora, parálisis irreversible, insuficiencia respiratoria y eventual muerte dentro de los 2-5 años posteriores al diagnóstico1. La ELA se asocia con defectos metabólicos como pérdida de peso, dislipidemia e hipermetabolismo (revisado en2); sin embargo, sigue sin estar claro cómo estas alteraciones en el metabolismo se relacionan con la degeneración de la neurona motora. Un denominador común en la ELA y las enfermedades neurodegenerativas relacionadas es TDP-43, una proteína de unión a ácidos nucleicos implicada en varios pasos del procesamiento del ARN3,4,5. Aunque las mutaciones en TDP-43 solo afectan al 3%-5% de los pacientes, la proteína TDP-43 de tipo salvaje se encuentra dentro de los agregados citoplasmáticos en >97% de los casos de ELA (revisado en6). Esta patología fue modelada en Drosophila por sobreexpresión de tipo salvaje humano o mutante TDP-43 (G298S) en neuronas motoras, que recapitula múltiples aspectos de la ELA, incluyendo inclusiones citoplasmáticas, disfunción locomotora y reducción de la vida útil7,8. Usando estos modelos, se informó recientemente que la proteinopatía TDP-43 causa un aumento significativo en los niveles de piruvato y ARNm fosfofructoquinasa (PFK), la enzima limitante de la velocidad de la glucólisis9. Se encontraron aumentos similares en las transcripciones de PFK en las neuronas motoras y la médula espinal derivadas de pacientes, lo que sugiere que la glucólisis está regulada al alza en el contexto de la proteinopatía TDP-43. Curiosamente, un aumento adicional en la glucólisis utilizando manipulaciones dietéticas y genéticas mitigó varios fenotipos de ELA, como la disfunción locomotora y el aumento de la vida útil en modelos de moscas de proteinopatía TDP-43, consistente con un mecanismo compensatorio y neuroprotector en las neuronas motoras degeneradas.
Para sondear aún más los cambios en la glucólisis y medir la absorción de glucosa en modelos de Drosophila de proteinopatía TDP-43, un sensor basado en FRET codificado genéticamente flII12Pglu-700μδ610 previamente informado se expresó en neuronas motoras utilizando específicamente el sistema de expresión UAS-GAL4. El sensor de glucosa FLII12Pglu-700μδ6 utiliza la transferencia de energía de resonancia entre dos variantes de proteína fluorescente verde, proteínas fluorescentes cian y amarillas (CFP y YFP) para detectar glucosa a nivel celular. Consiste en un dominio de unión a glucosa bacteriana del gen MglB de E. coli fusionado con CFP y YFP en extremos opuestos de la molécula. Cuando se une a una molécula de glucosa, el sensor sufre un cambio conformacional que acerca cfP y YFP y permite que ocurra FRET, que luego se puede usar para cuantificar los niveles de glucosa intracelular10,11,12 (Figura 1). Aquí, mostramos cómo el sensor FLII12Pglu-700μδ6 se puede utilizar para determinar los cambios en la absorción de glucosa causados por la proteinopatía TDP-43 en las neuronas motoras. Los experimentos descritos aquí muestran que la sobreexpresión de un mutante asociado a la ELA, TDP-43G298S,en las neuronas motoras causa un aumento significativo en la absorción de glucosa en comparación con los controles. Este enfoque se puede utilizar en otros tipos de ELA (por ejemplo, SOD1, C9orf72, etc.) y / u otros tipos de células (por ejemplo, glía, músculos) para determinar los cambios en la absorción de glucosa asociados con la neurodegeneración.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica descrita en detalle aquí se puede aplicar para medir la absorción de glucosa en un tipo celular específico de interés en Drosophila viva utilizando FLII12Pglu-700μδ6, un sensor basado en FRET que puede detectar cambios en los niveles de glucosa a un rango milimolar10,11,12. Este sensor se ha utilizado previamente en conjunto con el sistema UAS-GAL4 para dirigir su expresión a tipos celulares específi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Stefanie Schirmeier y Takeshi Iwatsubo por proporcionar cepas de Drosophila. También agradecemos a Patricia Jansma por ayudar con las imágenes en el Marley Imaging Core de la Universidad de Arizona. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud NIH NS091299, NS115514 (a DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (a EM) y el Programa de Investigación de Biología de Pregrado (a HB).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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