Crosstalk mellan bröst epitelial celler och endotel celler bidrar viktigt till bröstcancer progression, tumör tillväxt och metastasering. I denna studie har sfäroider tillverkats av bröstcancerceller tillsammans med kärl- och/eller lymfatiska endotelceller och visat deras tillämplighet som in vitro-system för bröstcancerforskning.
Bröstcancer är den främsta dödsorsaken hos kvinnor. Tillväxten av bröstcancerceller och deras efterföljande metastasering är en nyckelfaktor för dess progression. Även om mekanismerna som är involverade i att främja bröstcancer tillväxt har studerats intensivt med hjälp av monokulturer av bröstcancerceller såsom MCF-7 celler, har bidraget från andra celltyper, såsom vaskulär och lymfatiska endotelceller som är intimt involverade i tumörtillväxt, inte undersökts på djupet. Cell-cell interaktion spelar en nyckelroll i tumör tillväxt och progression. Neoangiogenes, eller utveckling av fartyg, är avgörande för tumör tillväxt, medan lymfsystemet fungerar som en portal för cancer cell migration och efterföljande metastasering. Nyligen genomförda studier ger bevis för att vaskulär och lymfatiska endotelceller kan påverka cancercellstillväxten avsevärt. Dessa observationer innebär ett behov av att utveckla in vitro-modeller som mer realistiskt skulle återspegla bröstcancertillväxtprocesser in vivo. Dessutom kräver begränsningar i djurforskningen att man utarbetar ex vivo-modeller för att bättre klargöra de berörda mekanismerna.
Denna artikel beskriver utvecklingen av bröstcancer sfäroider består av både bröstcancerceller (östrogen receptor-positiva MCF-7 celler) och vaskulär och/eller lymfatiska endotel celler. Protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-metod för att skapa tvåcelliga sfäroider med två olika metoder, hängande droppe (guldstandard och billig) och 96-brunns U-bottenplattor (dyra). Djupgående instruktioner ges för hur man försiktigt plockar upp de formade sfäroiderna för att övervaka tillväxten genom mikroskopisk storlek och bedömning av livskraften med hjälp av döda och levande cellfärgning. Dessutom avgränsas förfaranden för att fixa sfäroiderna för sektionering och färgning med tillväxtspecifika antikroppar för att skilja tillväxtmönster i sfäroider. Dessutom ges detaljer för att förbereda sfäroider med transfectedceller och metoder för att extrahera RNA för molekylär analys. Sammanfattningsvis ger denna artikel djupgående instruktioner för att förbereda flercelliga sfäroider för bröstcancerforskning.
Användningen av djur för experiment har begränsningar. Djurstudier kan inte exakt efterlikna sjukdomsprogression hos människor, och djur och människor har inte identiska svar på patogener. Dessutom kan begränsningar av djurförsök på grund av oro för djurs lidande och etiska problem1,2 allt mer begränsade forskningsprogram. In vitro System har utvecklats i stor utsträckning för att kringgå användningen av djur. Dessutom har användningen av mänskliga celler gjort att in vitro modeller som är mer relevanta för den patofysiologiska och terapeutiska undersökningen. Konventionella monolayer (2D) cellkulturer används ofta eftersom de efterliknar mänskliga vävnader i viss utsträckning. 2D-monokulturer kan dock inte efterlikna mänskliga organ, och 2D-monokulturer kan inte simulera den komplexa mikromiljön hos de ursprungliga organen och efterlikna in vivo situation3,4,5,6. Dessutom, i monolayer cell kulturer, läkemedelsbehandlingar kan lätt förstöra / skada alla celler. Viktigt är att vissa av dessa begränsningar kan övervinnas genom att byta till flerskikts tredimensionella (3D) cellkulturer7,8. Faktum är att 3D-kulturmodeller har visat sig bättre återspegla cellstrukturen, layouten och funktionen hos celler i primära vävnader. Dessa 3D-kulturer kan bildas med hjälp av en mängd olika cellinjer, som liknar ett funktionellt organ. Det finns faktiskt två modeller av 3D-kulturer. En modell producerar sfäroider av aggregerade celler som bildar kluster och omorganiserar dem till sfärer (byggnadsställningsfria modeller). Den andra ger organoider, som har en mer komplex struktur och består av kombinationer av flera organspecifika celler, som betraktas som en miniatyrversion av organ9,10. På grund av detta representerar 3D-odlingssystem en innovativ teknik med många biologiska och kliniska tillämpningar. Således har sfäroider och organoider många tillämpningar för sjukdomsmodellering och studier relaterade till regenerativ medicin, läkemedelsscreening och toxikologiska studier6,11,12,13,14,15. Cancerframkallande sfäroider, härledda från 3D-teknik, återskapar morfologi och fenotyp av relevanta celltyper, efterliknar in vivo tumörmikromiljön och modellcellkommunikation och signalvägar som är i drift under tumörutveckling16,17,18. För att förbättra förståelsen för cancerbiologi kan tumörsfäroider/organoider också användas för att identifiera en potentiell patientspecifik cancerbehandling (personlig) och bedöma dess effekt, toxicitet och långsiktiga effekter19,20,21,22. Sfäroider har öppnat framträdande möjligheter att undersöka patofysiologi, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening på grund av deras förmåga att bevara cellulär och tredimensionell vävnadsarkitektur, förmågan att efterlikna in vivo situationen och cell-cellinteraktionerna. Men man måste också vara medveten om begränsningarna i detta system, såsom bristen på vaskulär/ systemisk komponent, funktionellt immun- eller nervsystemet, och systemet representerar ett reduktionistiskt tillvägagångssätt jämfört med djurmodeller. I motsats till djurmodeller ger 3D-strukturer endast en approximation av biologin i en mänsklig kropp. Att förstå begränsningarna i 3D-metoden kan hjälpa forskare att utforma mer raffinerade och giltiga processer för att producera sfäroider som bättre representerar ett organ i större skala23,24,25.
Cancer är den främsta dödsorsaken i världen, och bröstcancer är den vanligaste cancerformen hos kvinnor26,27,28. För att efterlikna den komplexa mikromiljön av bröstcancer bör bröstcancer sfäroider odlas med celler som spelar en framträdande roll i brösttumörer, dvs. epitelceller, endotelceller, fibroblaster och/eller immunceller. Dessutom, för en sfäroid som representerar bröstcancer, bör uttrycket av kvinnliga hormonreceptorer (östrogen/ progesteronreceptorer), förmåga att bevara patientens tumör histologisk status och förmåga att efterlikna svar på terapi också övervägas. Studier har visat att 3D-samkultursystem har en cellulär organisation som liknar den primära vävnaden in vivo, har förmågan att reagera i realtid på stimuli och har funktionella androgenreceptorer29,30,31,32. Därför kan ett liknande tillvägagångssätt vara användbart för att efterlikna en brösttumör in vitro. Syftet med det nuvarande protokollet är att etablera en ny metod för att generera bröstcancersfäroider. Denna metod använder östrogen receptorpositiva MCF-7 celler (en odödliggjord mänsklig cellinje av epitelceller) och vaskulär endotelceller (HUVECs) eller lymfatiska endotelceller (HMVEC-DNeo) för att skapa en modell som efterliknar eller nära återspeglar interaktionerna mellan dessa celler i en tumör. Även om MCF-7 (östrogen-lyhörda) och endotelceller har använts för att utveckla sfäroider i den nuvarande studien, kan andra celler som fibroblaster som representerar ~ 80% av brösttumörmassan också kombineras i framtiden för att bättre representera och efterlikna brösttumör.
Det finns flera metoder för att bilda sfäroider, till exempel: 1) den hängande droppmetoden som användergravitationen 33,34; 2) den magnetiska levitationsmetoden som använder magnetiska nanopartiklar som utsätts för en extern magnet35och 3) den sfäroida mikroplatta som utförs av såddceller på lågtillsatta plattor36,37. På grundval av de befintliga metoderna, som endast använder en celltyp, har det nuvarande protokollet optimerats med epitel- och endotelceller för att bättre efterlikna tillväxtförhållandena för bröstcancertumörer i vivo38,39,40,41. Denna metod kan enkelt uppnås i laboratoriet till en låg kostnad och med minimala utrustningskrav. Baserat på labbets behov/mål användes olika metoder för att bilda sfäroider och få relevant cellulärt material från dessa sfäroider. I detta sammanhang, för DNA, RNA eller proteinanalys, produceras 3D-sfäroiderna genom samodling av endotel- och epitelceller med hängande droppmetod. Men för funktionella studier, till exempel, för att övervaka celltillväxt efter kort störande (siRNA) transfektion och/eller hormonbehandling, sfäroiderna genereras med hjälp av U-bottenplattor.
Syftet med detta tekniska protokoll är att tillhandahålla en detaljerad steg-för-steg beskrivning för 1) bilda bröstcancer multicellulär-typ sfäroider, 2) förbereda prover för histologiska färgning, och 3) samling av celler för extraktion av RNA, DNA och proteiner. Både den billiga hängande droppmetoden och de dyrare U-bottenplattorna används för att bilda sfäroider. Här tillhandahålls ett protokoll för att förbereda (fixa) sfäroider för sektionering och efterföljande immunstaining med markörer för att bedöma cellproliferation, apoptos och distribution av epitelial och endotelceller inom en sfäroid. Dessutom visar detta protokoll en fullständig steg-för-steg-analys av histologiska data med hjälp av ImageJ-programvara. Tolkningen av biologiska data varierar beroende på vilken typ av experiment och vilka antikroppar som används. Sektionering av fasta sfäroider och efterföljande färgning av sektionerna utfördes av ett rutinmässigt patologilabb (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
Jämfört med 2D-cellkulturer är revolutionerande 3D-sfäroidkulturteknik ett bättre och kraftfullare verktyg för att rekonstruera ett organs mikromiljö, cellcellsinteraktioner och läkemedelssvar in vitro. Detta är det första protokollet som beskriver bildandet av sfäroider från multicellulära (epiteliella och endotel) cellinjer för bröstcancerforskning. Detta protokoll säkerställer sfäroidal 3D tillväxt av sfäroider i upp till 5 dagar, och sfäroider kan undersökas efter paraffin inbäddning, …
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 till RKD och National Institute of Health grant DK079307 till EKJ.
100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
149MULTI0C1 | |||
35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |