מודל פשוט להשתלת מסתם לב הטרוטופי במכרסמים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה להשתלת עלוני מסתם אבי העורקים מתחת לכמוסה הכליתית כדי לאפשר מחקר של אלוראקטיביות של מסתמי הלב.
Abstract
יש צורך קליני דחוף בתחליפי מסתמי לב שיכולים לגדול אצל ילדים. השתלת מסתם הלב מוצעת כסוג חדש של השתלה עם פוטנציאל לספק מסתמי לב עמידים המסוגלים לצמיחה סומטית ללא צורך בנוגדי קרישה. עם זאת, האימונוביולוגיה של השתלות מסתמי לב עדיין לא נחקרה, מה שמדגיש את הצורך במודלים של בעלי חיים כדי לחקור סוג חדש זה של השתלה. מודלים קודמים של חולדות להשתלת מסתם אבי העורקים ההטרוטופי באבי העורקים הבטני תוארו, אם כי הם מאתגרים מבחינה טכנית ויקרים. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותח מודל השתלה תת-קפסולרית של הכליה במכרסמים כשיטה מעשית ופשוטה יותר לחקר אימונוביולוגיה של השתלת מסתמי לב. במודל זה, עלון שסתום אבי העורקים יחיד נקטף ומוכנס לחלל התת-קפסולרי הכלייתי. הכליה נגישה בקלות, והרקמה המושתלת מוכלת היטב בחלל תת-קפסולרי שהוא כלי דם היטב ויכול להכיל מגוון גדלי רקמות. יתר על כן, מכיוון שחולדה בודדת יכולה לספק שלושה עלוני אבי העורקים של התורם וכליה אחת יכולה לספק מספר אתרים לרקמות מושתלות, פחות חולדות נדרשות למחקר נתון. כאן מתוארת טכניקת ההשתלה, המספקת צעד משמעותי קדימה בחקר אימונולוגיה של השתלת מסתמי לב.
Introduction
מומי לב מולדים הם הנכות המולדת הנפוצה ביותר בבני אדם, המשפיעים על 7 מתוך 1,000 ילדים שנולדו חיים בכל שנה1. בניגוד לחולים מבוגרים בהם מושתלים באופן שגרתי מסתמים מכניים וביו-פרוסטטיים שונים, למטופלים בילדים אין כיום אפשרויות טובות להחלפת מסתם. לשתלים קונבנציונליים אלה אין פוטנציאל לגדול אצל ילדים מושתלים. כתוצאה מכך, ניתוחים חוזרים חולניים נדרשים כדי להחליף את שתלי מסתם הלב בגרסאות גדולות יותר ברצף ככל שהילדים גדלים, כאשר ילדים מושפעים נזקקים לעתים קרובות לעד חמישה ניתוחי לב פתוח או יותר במהלך חייהם 2,3. מחקרים הראו כי החופש מהתערבות או ממוות דל באופן משמעותי בתינוקות מאשר בילדים גדולים יותר, כאשר 60% מהתינוקות עם מסתמי לב תותבים עומדים בפני ניתוח חוזר או מוות תוך 3 שנים מהניתוח הראשוני שלהם4. לכן, יש צורך דחוף לספק מסתם לב שיכול לגדול ולשמור על תפקוד בחולי ילדים.
במשך עשרות שנים, ניסיונות לספק תחליפי מסתמי לב הולכים וגדלים התרכזו בהנדסת רקמות ובתאי גזע. עם זאת, הניסיונות לתרגם מסתמים אלה למרפאה לא צלחו עד כה 5,6,7,7,8. כדי להתמודד עם זה, השתלת מסתם לב מוצעת כפעולה יצירתית יותר למתן תחליפי מסתמי לב הולכים וגדלים בעלי יכולת לתקן את עצמם ולהימנע מתרומבוגנזה. במקום להשתיל את כל הלב, רק מסתם הלב מושתל ואז יגדל עם הילד המושתל, בדומה להשתלת לב קונבנציונלית או לחתימה ריאתית של רוס 9,10,11. לאחר הניתוח, ילדים מושתלים יקבלו דיכוי חיסוני עד שניתן יהיה להחליף את המסתם המושתל בתותבת מכנית בגודל מבוגר כאשר צמיחת המסתם אינה נדרשת עוד. עם זאת, הביולוגיה של ההשתלות של השתלות מסתמי הלב נותרה ללא בדיקה. לכן, יש צורך במודלים של בעלי חיים כדי לחקור סוג חדש זה של השתלה.
מספר מודלים של חולדות תוארו בעבר להשתלה הטרוטופית של המסתם אבי העורקים לתוך אבי העורקים הבטני12,13,14,15,16,17,18. עם זאת, מודלים אלה הם מסובכים מאוד, ולעתים קרובות דורשים מנתחים מיומנים לנתח בהצלחה. בנוסף, הם יקרים וגוזלים זמןרב 19. מודל חדש של חולדות פותח כדי ליצור מודל חייתי פשוט יותר לחקר האימונוביולוגיה של השתלות מסתמי לב. עלוני מסתם אבי העורקים הבודדים נכרתים ומוכנסים לחלל התת-קפסולרי הכלייתי. הכליה מתאימה במיוחד לחקר דחיית ההשתלה מכיוון שהיא מאוד וסקולרית עם גישה לתאי חיסון במחזור20,21. בעוד שכמה אחרים השתמשו במודל תת-קפסולרי כלייתי כדי לחקור את הביולוגיה של ההשתלות של השתלות אלוגרפט אחרות כגון לבלב, כבד, כליה וקרנית 22,23,24,25,26,27, זהו התיאור הראשון של השתלת רקמת לב במצב זה. כאן מתוארת טכניקת ההשתלה, המספקת צעד משמעותי קדימה בחקר אימונולוגיה של השתלת מסתמי לב.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשיבות ויישומים פוטנציאליים
בעוד שמסתמי לב מכניים וביו-פרוסטטיים משמשים באופן שגרתי בחולים מבוגרים הזקוקים להחלפת מסתם, מסתמים אלה חסרים פוטנציאל לגדול, ולכן הם אינם אופטימליים עבור מטופלים ילדים. השתלת מסתמי לב היא פעולה ניסיונית שנועדה לספק תחליפי מסתמי לב הולכים וגדלים לי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
איור 1 נוצר עם biorender.com. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תוכנית החוקרים הכירורגיים של קרן AATS ל- TKR, קרן המצוינות לילדים המוחזקת על ידי המחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ל- TKR, מענק קרן אמרסון רוז לב ל- TKR, פילנתרופיה על ידי הסנאטור פול קמפבל ל- TKR, מענקי הכשרה לפוסט-דוקטורט מוסדיים של NIH-NHLBI (T32 HL-007260) ל- JHK ו- BG, והאוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה קולג ‘ לרפואה לפני פקידות קרן מחקר FLEX ל- MAH.
Materials
| 0.9% Sodium Chlordie, USP | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4-0 Polyglactin 910 | Ethicon | J415H | |
| 7.5% Povidone-Iodine | CareFusion | 29904-004 | |
| 70% ETOH | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Harvard Apparatus | 75-2030 | Air-tight inducton chamber for rats |
| Anesthesia machine | Harvard Apparatus | 75-0238 | Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging |
| Anesthesia Mask | Harvard Apparatus | 59-8255 | Rat anesthesia mask |
| Brown Norway Rats (BN/Crl) | Charles River | Strain Code 091 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | 0.03 mg/kg, administered subcutaneously |
| Electric hair clippers | WAHL | 79434 | |
| Electric Heating Pad | Harvard Apparatus | 72-0492 | Maintained at 36-38 °C |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | 100U/100g injection into the left atrium |
| Insulin Syringe, 1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| Iris forceps curved | World Precision Instruments | 15917 | |
| Iris forceps straight | World Precision Instruments | 15916 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen |
| Lewis Rats (LEW/ Crl) | Charles River | Strain Code 004 | Male, 5-7 weeks, 100-200 g |
| Micro forceps | World Precision Instruments | 500233 | Dumont #5 |
| Micro scissors | World Precision Instruments | 501930 | Spring-loaded Vannas Scissors |
| Needle Driver | World Precision Instruments | 500226 | Ryder Needle Driver |
| Operating microscope | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x – 90x Stereo Microscope |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Skin staples | Ethicon | PXR35 | Proximate 35 |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 1WC | |
| Sterile gauze sponges | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 1962C | Metzenbaum Scissors |
| University of Wisconsin Buffer (Servator B) | S.A.L.F S.p.A. | 6484A1 | Stored at 4 °C |
References
- Van Der Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: A systematic review and meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Jacobs, J. P., et al. Reoperations for pediatric and congenital heart disease: An analysis of the Society of Thoracic Surgeons (STS) congenital heart surgery database. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 17 (1), 2-8 (2014).
- Syedain, Z. H., et al. Pediatric tri-tube valved conduits made from fibroblast-produced extracellular matrix evaluated over 52 weeks in growing lambs. Science Translational Medicine. 13 (585), 1-16 (2021).
- Khan, M. S., Samayoa, A. X., Chen, D. W., Petit, C. J., Fraser, C. D. Contemporary experience with surgical treatment of aortic valve disease in children. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 146 (3), 512-521 (2013).
- Boyd, R., Parisi, F., Kalfa, D. State of the art: Tissue engineering in congenital heart surgery. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31 (4), 807-817 (2019).
- Feins, E. N., Emani, S. M. Expandable valves, annuloplasty rings, shunts, and bands for growing children. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 23, 17-23 (2020).
- Lintas, V., et al. TCT-795 Human cell derived off-the-shelf tissue engineered heart valves for next generation transcatheter aortic valve replacement: a proof-of-concept study in adult sheep. Journal of the American College of Cardiology. 70 (18), 271 (2017).
- Blum, K. M., Drews, J. D., Breuer, C. K. Tissue-engineered heart valves: A call for mechanistic studies. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (3), 240-253 (2018).
- Bernstein, D., et al. Cardiac growth after pediatric heart transplantation. Circulation. 85 (4), 1433-1439 (1992).
- Delmo Walter, E. M., et al. Adaptive growth and remodeling of transplanted hearts in children. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 40 (6), 1374-1383 (2011).
- Simon, P., et al. Growth of the pulmonary autograft after the Ross operation in childhood. Europeon Journal of Cardiothoracic Surgery. 19 (2), 118-121 (2001).
- Oei, F. B. S., et al. A size-matching heterotopic aortic valve implantation model in the rat. Journal of Surgical Research. 87 (2), 239-244 (1999).
- Oei, F. B. S., et al. Heart valve dysfunction resulting from cellular rejection in a novel heterotopic transplantation rat model. Transplant International. 13, (2000).
- El Khatib, H., Lupinetti, F. M. Antigenicity of fresh and cryopreserved rat valve allografts. Transplantation. 49 (4), 765-767 (1990).
- Yankah, A. C., Wottge, H. U. Allograft conduit wall calcification in a model of chronic arterial graft rejection. Journal of Cardiac Surgery. 12 (2), 86-92 (1997).
- Moustapha, A., et al. Aortic valve grafts in the rat: Evidence for rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 114 (6), 891-902 (1997).
- Légaré, J. F., et al. Prevention of allograft heart valve failure in a rat model. Journal of Thoracic and Cardiovascualr Surgery. 122 (2), 310-317 (2001).
- Legare, J. F., Lee, T. D. G., Creaser, K., Ross, D. B., Green, M. T lymphocytes mediate leaflet destruction and allograft aortic valve failure in rats. The Annals of Thoracic Surgery. 70 (4), 1238-1245 (2000).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Burgin, M., et al. Kidney Subcapsular Allograft Transplants as a Model to Test Virus-Derived Chemokine-Modulating Proteins as Therapeutics. Methods in molecular biology. 2225, 257-273 (2021).
- Foglia, R. P., DiPreta, J., Donahoe, P. K., Statter, M. B. Fetal allograft survival in immunocompetent recipients is age dependent and organ specific. Annals of Surgery. 204 (4), 402-410 (1986).
- Cunha, G. R., Baskin, L. Use of sub-renal capsule transplantation in developmental biology. Differentiation. 91 (4-5), 4-9 (2016).
- Hori, J., Joyce, N., Streilein, J. W. Epithelium-deficient corneal allografts display immune privilege beneath the kidney capsule. Investigative Opthalmology & Visual Science. 41 (2), 443-452 (2000).
- Mandel, T., et al. transplantation of organ cultured fetal pig pancreas in non-obese diabetic (NOD) mice and primates (Macaca fascicularis). Xenotransplantation. 2 (3), 128-132 (1995).
- Ricordi, C., Flye, M. W., Lacy, P. E. Renal subcapsular transplantation of clusters of hepatocytes in conjunction with pancreatic islets. Transplantation. 45 (6), 1148-1150 (1988).
- Shultz, L. D., et al. Subcapsular transplantation of tissue in the kidney. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 737-740 (2014).
- Vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Mitchell, R. N., Jonas, R. A., Schoen, F. J. Pathology of explanted cryopreserved allograft heart valves: Comparison with aortic valves from orthotopic heart transplants. Journal of Thoracic and Cardiovasular Surgery. 115 (1), 118-127 (1998).
- Valante, M., et al. The aortic valve after heart transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 60, (1995).
- O’Brien, M. F., Stafford, E. G., Gardner, M. A. H., Pohlner, P. G., McGiffin, D. C. A comparison of aortic valve replacement with viable cryopreserved and fresh allograft valves, with a note on chromosomal studies. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 94 (6), 812-823 (1987).
- Ng, T. F., Osawa, H., Hori, J., Young, M. J., Streilein, J. W. Allogeneic neonatal neuronal retina grafts display partial immune privilege in the subcapsular space of the kidney. The Journal of Immunology. 169 (10), 5601-5606 (2002).
- Heslop, B. F., Wilson, S. E., Hardy, B. E. Antigenicity of aortic valve allografts. Annals of Surgery. 177 (3), 301-306 (1973).
- Steinmuller, D., Weiner, L. J. Evocation and persistence of transplantation immunity in rats. Transplantation. 1 (1), 97-106 (1963).
- Billingham, R. E., Brent, L., Brown, J. B., Medawar, P. B. Time of onset and duration of transplantation immunity. Plastic and Reconstructive Surgery. 24 (1), 410-413 (1959).
- Tector, A. J., Boyd, W. C., Korns, M. E. Aortic valve allograft rejection. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 62 (4), 592-601 (1971).
- Sugimura, Y., Schmidt, A. K., Lichtenberg, A., Akhyari, P., Assmann, A. A rat model for the in vivo assessment of biological and tissue-engineered valvular and vascular grafts. Tissue Engineering Methods (Part C). 23 (12), 982-994 (2017).
