Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

Summary

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle critique de la protéine, dont le dérèglement a été impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Ce protocole détaille comment l’affichage des phages peut être utilisé pour isoler de nouvelles variantes d’ubiquitine qui peuvent lier et moduler l’activité des ligas E3 qui contrôlent la spécificité, l’efficacité et les modèles d’ubiquitination.

Abstract

L’ubiquitine est une petite protéine de 8,6 kDa qui est un composant central du système ubiquitine-protéasome. Par conséquent, il peut se lier à un large éventail de protéines avec une spécificité élevée mais une faible affinité. Grâce à l’affichage des phages, les variantes de l’ubiquitine (UbV) peuvent être conçues de manière à présenter une affinité améliorée par rapport à l’ubiquitine de type sauvage et à maintenir une spécificité de liaison aux protéines cibles. L’affichage des phages utilise une bibliothèque de phagémides, dans laquelle la protéine de la couche pIII d’un bactériophage filamenteux M13 (choisie parce qu’elle est affichée à l’extérieur sur la surface du phage) est fusionnée avec des UbV. Les résidus spécifiques de l’ubiquitine de type sauvage humain sont mous et randomisés (c.-à-d. qu’il existe un biais vers la séquence de type sauvage indigène) pour générer des UbV afin d’éviter les changements délétères dans la conformation des protéines tout en introduisant la diversité nécessaire pour promouvoir de nouvelles interactions avec la protéine cible. Au cours du processus d’affichage des phages, ces UbV sont exprimés et affichés sur les protéines de la couche de phage et placés contre une protéine d’intérêt. Les UbV qui présentent des interactions de liaison favorables avec la protéine cible sont conservés, tandis que les liants pauvres sont emportés et retirés du pool de la bibliothèque. Les UbV retenus, qui sont attachés à la particule de phage contenant le phagémide correspondant de l’UbV, sont élués, amplifiés et concentrés de sorte qu’ils puissent être placés contre la même protéine cible dans une autre série d’affichage de phages. En règle générale, jusqu’à cinq cycles d’affichage de phages sont effectués, au cours desquels une forte pression de sélection est imposée contre les UbV qui se lient faiblement et / ou promiscuité afin que ceux ayant des affinités plus élevées soient concentrés et enrichis. En fin de compte, les UbV qui démontrent une spécificité et/ou une affinité plus élevée pour la protéine cible que leurs homologues de type sauvage sont isolés et peuvent être caractérisés par d’autres expériences.

Introduction

Comprendre les détails moléculaires des interactions protéine-protéine est essentiel pour délimiter les mécanismes de transduction du signal des processus biologiques, en particulier ceux qui contribuent à des maladies cliniquement importantes. Au cours des dernières années, l’affichage des phages a été utilisé comme une méthode pratique et accessible pour isoler les protéines / peptides avec une liaison beaucoup améliorée à une protéine cible souhaitée1,2,3,4, qui à son tour peut être utilisée comme sonde intracellulaire des interactions protéine-protéine.

L’ubiquitination est une cascade d’activités enzymatiques (enzyme activatrice E1 → enzyme conjuguante E2 → ligas E3) qui conjuguent de manière covalente l’ubiquitine (Ub) aux substrats protéiques pour les cibler pour la dégradation ou pour arbitrer les changements de signalisation cellulaire. De plus, les déubiquitinases catalysent l’élimination de l’ubiquitine des protéines. Par conséquent, dans les cellules, il existe des milliers d’interactions protéine-protéine dépendantes de l’Ub, dont la grande majorité reconnaît une surface commune avec une faible affinité mais une spécificité élevée pour permettre des interactions faibles à travers des surfaces grandes et diverses.

Ernst et al. ont introduit des mutations dans des régions de liaison connues d’Ub afin de voir si elles pouvaient améliorer l’affinité de liaison pour une protéine d’intérêt tout en maintenant une sélectivité ^élevée5. Une bibliothèque combinatoire de plus de 10 milliards (7,5 x ¹⁰¹⁰) de variantes Ub (UbV) avec des mutations à des positions à travers la surface Ub qui médient les interactions Ub-protéine connues a été développée. Cette bibliothèque était composée de phagémides qui expriment la protéine de la couche de bactériophage PIII M13 fusionnée à des UbV diversifiés. Par conséquent, les UbV individuels peuvent être affichés à la surface du phage via la protéine de la couche lors de l’expression. Au cours du processus de sélection, les phages qui présentent des UbV avec des interactions de liaison considérables avec la protéine cible seront conservés et enrichis dans les cycles suivants d’affichage des phages, tandis que les phages affichant des UbV qui se lient mal à la protéine cible sont lavés et retirés du pool de phages. Les particules de phage retenues contiennent le phagémide correspondant à leur UbV affiché, ce qui leur permet d’être séquencées et caractérisées une fois isolées.

En utilisant cette stratégie d’ingénierie des protéines, des inhibiteurs de l’UbV ont été développés pour les déubiquitinases5 humaines et les protéases ^virales6. Il est important de noter que nous avons généré des UbV inhibiteurs pour les ligas E3 de la famille HECT humaine en détournant le site de liaison E2 et en activant les UbV qui occupent un exosite de liaison Ub sur le domaine ^HECT7. Nous pouvons également inhiber les E3 monomères de la famille RING en ciblant le site de liaison E2 et induire la dimérisation UbV pour activer l’anneau homodimérique ^E3s8. Pour les RING E3 multi-sous-unités, les UbV peuvent provoquer une inhibition en ciblant la sous-unité RING (par exemple, pour le complexe APC/^C9) ou en perturbant la formation de complexes (par exemple, pour SCF ^E3s10). Collectivement, les UbV peuvent être exploités pour interroger systématiquement les interactions protéine-protéine dans le système Ub-protéasome (UPS) afin que nous puissions mieux déchiffrer les mécanismes biochimiques des enzymes UPS et identifier et valider les sites fonctionnels pour une intervention thérapeutique.

Le protocole suivant décrit comment utiliser une bibliothèque UbV affichée par un phage précédemment générée pour cibler une protéine d’intérêt et comment enrichir les liants UbV qui interagissent avec la protéine cible à travers des cycles successifs d’affichage des phages.

Protocol

1. Préparation du réactif PBS (solution saline tamponnée au phosphate) : Mélanger 50 mL de solution 10x PBS avec 450 mL de H2O ultrapur. Stériliser par filtration et conserver à 4 °C ou température ambiante (~20-25 °C). 10% de BSA (albumine sérique bovine) : Ajouter lentement 1 g de BSA à 7 mL de H2O ultrapur et mélanger jusqu’à dissolution complète (pas d’amas). Complétez avec du H2O ultrapur jusqu’à ce que le volume final soit de 10 mL. Stérili…

Representative Results

Les liants produits à partir de l’affichage des phages peuvent être vérifiés et analysés de plusieurs façons. Il est recommandé de procéder d’abord au séquençage du phage avec des amorces qui flanquent l’insert diversifié dans la bibliothèque de phagémides. Une expérience d’affichage de phages idéale montrera un biais clair vers plusieurs séquences (Figure 1). D’autres séquences seront également présentes mais avec un nombre plus faible, apparaissant davantage co…

Discussion

Comme mentionné à l’étape 2.1 (préparation des protéines), une variété de méthodes peuvent être utilisées pour évaluer la concentration en protéines, et chacune aura des avantages et des inconvénients uniques en fonction de la protéine cible spécifique utilisée pour l’affichage des phages. Une source de descriptions détaillées et de protocoles pour les méthodes populaires a déjà été ^fournie11.

L’utilisation du phage retenu par un affichage d…

Materials

Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.