Utilizzo di Phage Display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per le ligasi E3

Summary

L’ubiquitinazione è una modificazione post-traduzionale critica della proteina, la cui disregolazione è stata implicata in numerose malattie umane. Questo protocollo descrive in dettaglio come la visualizzazione dei fagi può essere utilizzata per isolare nuove varianti di ubiquitina in grado di legare e modulare l’attività delle ligasi E3 che controllano la specificità, l’efficienza e i modelli di ubiquitinazione.

Abstract

L’ubiquitina è una piccola proteina da 8,6 kDa che è un componente fondamentale del sistema ubiquitina-proteasoma. Di conseguenza, può legarsi a una vasta gamma di proteine con elevata specificità ma bassa affinità. Attraverso la visualizzazione dei fagi, le varianti di ubiquitina (UbV) possono essere progettate in modo tale da mostrare una migliore affinità rispetto all’ubiquitina wildtype e mantenere la specificità di legame alle proteine bersaglio. Il display dei fagi utilizza una libreria fagemidica, in cui la proteina del mantello pIII di un batteriofago filamentoso M13 (scelto perché visualizzato esternamente sulla superficie del fago) viene fuso con UbV. I residui specifici di ubiquitina wildtype umana sono morbidi e randomizzati (cioè, c’è una propensione verso la sequenza wildtype nativa) per generare UbV in modo che vengano evitati cambiamenti deleteri nella conformazione proteica introducendo la diversità necessaria per promuovere nuove interazioni con la proteina bersaglio. Durante il processo di visualizzazione dei fagi, questi UbV vengono espressi e visualizzati sulle proteine del rivestimento fagico e panned contro una proteina di interesse. Gli UbV che mostrano interazioni di legame favorevoli con la proteina bersaglio vengono mantenuti, mentre i leganti poveri vengono lavati via e rimossi dal pool della biblioteca. Gli UbV trattenuti, che sono attaccati alla particella fagica contenente il fagemide corrispondente dell’UbV, sono eluiti, amplificati e concentrati in modo che possano essere panned contro la stessa proteina bersaglio in un altro round di visualizzazione dei fagi. Tipicamente, vengono eseguiti fino a cinque cicli di visualizzazione dei fagi, durante i quali viene imposta una forte pressione di selezione contro gli UbV che si legano debolmente e / o promiscuamente in modo che quelli con affinità più elevate siano concentrati e arricchiti. In definitiva, gli UbV che dimostrano una maggiore specificità e/o affinità per la proteina bersaglio rispetto alle loro controparti wildtype sono isolati e possono essere caratterizzati attraverso ulteriori esperimenti.

Introduction

Comprendere i dettagli molecolari delle interazioni proteina-proteina è fondamentale per delineare i meccanismi di trasduzione del segnale dei processi biologici, in particolare quelli che contribuiscono a malattie clinicamente importanti. Negli ultimi anni, la visualizzazione dei fagi è stata utilizzata come metodo pratico e accessibile per isolare proteine / peptidi con un legame molto migliorato a una proteina bersaglio ^{desiderata1,2,3,4}, che a sua volta può essere utilizzata come sonde intracellulari di interazioni proteina-proteina.

L’ubiquitinazione è una cascata di attività enzimatiche (enzima attivante E1 → enzima coniugante E2 → ligasi E3) che coniugano covalentemente l’ubiquitina (Ub) a substrati proteici per indirizzarli alla degradazione o per mediare i cambiamenti di segnalazione cellulare. Inoltre, le deubiquitinasi catalizzano la rimozione dell’ubiquitina dalle proteine. Pertanto, nelle cellule, ci sono migliaia di interazioni proteina-proteina ub-dipendenti, la stragrande maggioranza delle quali riconosce una superficie comune con bassa affinità ma alta specificità per consentire interazioni deboli attraverso superfici ampie e diverse.

Ernst et al. hanno introdotto mutazioni in regioni di legame note di Ub per vedere se potevano migliorare l’affinità di legame per una proteina di interesse pur mantenendo un’elevata ^{selettività5}. È stata sviluppata una libreria combinatoria di oltre 10 miliardi (7,5 x ¹⁰¹⁰) varianti di Ub (UbV) con mutazioni in posizioni sulla superficie Ub che mediano le interazioni Ub-proteina conosciute. Questa libreria consisteva di fagemidi che esprimono la proteina del rivestimento del batteriofago M13 pIIII fusa in UbV diversificati. Pertanto, i singoli UbV possono essere visualizzati sulla superficie del fago tramite la proteina del mantello al momento dell’espressione. Durante il processo di selezione, i fagi che mostrano UbV con notevoli interazioni di legame con la proteina bersaglio saranno mantenuti e arricchiti nei successivi cicli di visualizzazione dei fagi, mentre i fagi che mostrano UbV che si legano male alla proteina bersaglio vengono lavati via e rimossi dal pool fagico. Le particelle di fagi trattenute contengono il fagemino corrispondente al loro UbV visualizzato, consentendo loro di essere sequenziati e ulteriormente caratterizzati una volta isolati.

Utilizzando questa strategia di ingegneria proteica, sono stati sviluppati inibitori UbV per le deubiquitinasi ^umane5 e le proteasi ^virali6. È importante sottolineare che abbiamo generato UbV inibitori per le ligasi E3 della famiglia HECT umana attraverso il dirottamento del sito di legame E2 e l’attivazione di UbV che occupano un esosite Ub-binding sul dominio ^HECT7. Possiamo anche inibire gli E3 monomerici della famiglia RING prendendo di mira il sito di legame E2 e indurre la dimerizzazione UbV per attivare l’ANELLO omodimerico ^E3s8. Per gli RING E3 multi-subunità, gli UbV possono ottenere l’inibizione prendendo di mira la subunità RING (ad esempio, per il complesso APC/ ^C9) o interrompendo la formazione di complessi (ad esempio, per SCF ^E3s10). Collettivamente, gli UbV possono essere sfruttati per interrogare sistematicamente le interazioni proteina-proteina nel sistema Ub-proteasoma (UPS) in modo da poter decifrare meglio i meccanismi biochimici degli enzimi UPS e identificare e convalidare i siti funzionali per l’intervento terapeutico.

Il seguente protocollo descrive come impiegare una libreria UbV visualizzata da fagi generati in precedenza per indirizzare una proteina di interesse e come arricchire i leganti UbV che interagiscono con la proteina bersaglio attraverso cicli successivi di visualizzazione dei fagi.

Protocol

1. Preparazione del reagente PBS (soluzione salina tamponata con fosfato): mescolare 50 mL di soluzione 10x PBS con 450 mL di H2O ultrapuro. Sterilizzare mediante filtrazione e conservare a 4 °C o temperatura ambiente (~20-25 °C). 10% BSA (albumina sierica bovina): aggiungere lentamente 1 g di BSA a 7 ml di H2O ultrapuro e mescolare fino a completa dissoluzione (senza grumi). Ricaricare con H2O ultrapuro fino a quando il volume finale è di 10 ml. Sterilizzare per fi…

Representative Results

I leganti prodotti dal display dei fagi possono essere verificati e analizzati in molti modi. Si raccomanda di procedere prima con il sequenziamento del fago con primer che affiancano l’inserto diversificato nella libreria fagemimidica. Un esperimento di visualizzazione ideale dei fagi mostrerà una chiara inclinazione verso diverse sequenze (Figura 1). Saranno presenti anche altre sequenze ma con un conteggio inferiore, apparendo più come rumore di fondo. Nell’esempio fornito, dove la visu…

Discussion

Come accennato nel passaggio 2.1 (preparazione delle proteine), è possibile utilizzare una varietà di metodi per valutare la concentrazione proteica e ciascuno avrà vantaggi e svantaggi unici in base alla specifica proteina bersaglio utilizzata per la visualizzazione dei fagi. In precedenza è stata fornita una fonte di descrizioni e protocolli dettagliati per i metodi più ^diffusi11.

L’uso del fago trattenuto da un precedente ciclo di visualizzazione dei fagi come i…

Materials

Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack)	Fisher Scientific	14-222-198	Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V	BioShop Canada	ALB001	Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous	Millipore-Sigma	C1389-5G	Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate	Fisher Scientific	7000133	Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500	Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate	Fisher Scientific	AAJ1792406	Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage	New England Biolabs	N0315S	Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom	Life Technologies	44-2404-21	Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution	Fisher Scientific	BP3994	Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation	VWR	60941-120	Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Phage precipitation.
Sodium chloride	Millipore-Sigma	S3014	Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene	Fisher Scientific	14-956-1D	Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder	Fisher Scientific	BP1421-2	Cell growth media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffer component.
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Cell growth media component.