Summary
Les régulateurs des fonctions mélanocytaires régissent les différences visibles dans le résultat de la pigmentation. Déchiffrer la fonction moléculaire du gène de pigmentation candidat pose un défi. Ici, nous démontrons l’utilisation d’un système modèle de poisson zèbre pour identifier les candidats et les classer en régulateurs de la teneur en mélanine et du nombre de mélanocytes.
Abstract
Les mélanocytes sont des cellules spécialisées dérivées de la crête neurale présentes dans la peau épidermique. Ces cellules synthétisent un pigment de mélanine qui protège le génome des rayons ultraviolets nocifs. Les perturbations du fonctionnement des mélanocytes entraînent des troubles pigmentaires tels que le piébaldisme, l’albinisme, le vitiligo, le mélasma et le mélanome. Le poisson zèbre est un excellent système modèle pour comprendre les fonctions des mélanocytes. La présence de mélanocytes pigmentés visibles, la facilité de manipulation génétique et la disponibilité de lignées fluorescentes transgéniques facilitent l’étude de la pigmentation. Cette étude utilise l’utilisation de lignées de poissons-zèbres de type sauvage et transgéniques qui entraînent l’expression de protéines fluorescentes vertes (GFP) sous les promoteurs mitfa et tyrp1 qui marquent différents stades des mélanocytes.
Le silençage morpholino des gènes candidats est réalisé pour évaluer le résultat phénotypique sur la pigmentation larvaire et est applicable au dépistage des régulateurs de pigmentation. Ce protocole démontre la méthode de microinjection à l’imagerie et à la dissection basée sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de phénotypes en utilisant deux gènes candidats, l’anhydrase carbonique 14 (Ca14) et une variante d’histones (H2afv), pour évaluer de manière exhaustive le résultat de la pigmentation. De plus, ce protocole démontre la ségrégation des gènes candidats en spécificateurs et différenciateurs de mélanocytes qui modifient sélectivement le nombre de mélanocytes et la teneur en mélanine par cellule, respectivement.
Introduction
Alors que l’utilisation de la mélanine pour la photoprotection a évolué plusieurs fois dans le règne animal, les vertébrés ont apparemment perfectionné le processus. Les cellules productrices de pigments dédiées avec une machinerie élaborée pour synthétiser et contenir la mélanine sont conservées des poissons aux humains1. Cependant, le résultat de la pigmentation est considérablement varié, allant de la couleur à la récipience et se présente sous forme de motifs vifs sur les téguments, la peau et les cheveux2. Malgré la diversité, le répertoire des gènes impliqués dans la réponse pigmentaire est remarquablement conservé. Les composants de base de la machinerie de synthèse de mélanine, tels que les enzymes clés de synthèse de mélanine, les composants des mélanosomes et la connectivité en amont à la voie de signalisation, restent essentiellement identiques d’un organisme à l’autre. Des différences génétiques subtiles entraînent des changements spectaculaires dans les schémas de pigmentation observés chez les espèces3. Ainsi, une approche génétique inverse chez un organisme vertébré inférieur, le poisson-zèbre (Danio rerio), offre une excellente occasion de déchiffrer l’implication des gènes dans le rendu de l’état pigmenté4.
Les embryons de poisson zèbre se développent à partir d’un zygote fécondé unicellulaire à une larve dans un laps de ~24 h après la fécondation (HPF)5. Il est frappant de constater que les cellules équivalentes aux mélanocytes - les mélanophores - sont de grandes cellules présentes dans le derme et qui sont visibles en raison de la teneur en mélanine foncée6. Ces cellules dérivées de la crête neurale émanent ~11 hpf et commencent à pigmenter ~24 hpf 6,7. Les modules d’expression génique conservés ont permis d’identifier des facteurs clés qui orchestrent les fonctions mélanocytaires et ont conduit au développement de lignées de rapporteurs fluorescents transgéniques Tg(sox10:GFP), Tg(mitfa:GFP) et Tg(ftyrp1:GFP)8,9,10 qui marquent des stades sélectifs du développement des mélanocytes. L’utilisation de ces lignées de poissons transgéniques permet d’interroger la biologie cellulaire des mélanocytes au niveau de l’organisme dans le contexte tissulaire avec des indices appropriés en fonction des délais de développement. Ces rapporteurs complètent la quantification pigmentaire des mélanocytes et permettent une évaluation distincte du nombre de mélanocytes, quelle que soit la teneur en mélanine.
Cet article fournit un protocole détaillé pour déchiffrer la biologie des mélanocytes en évaluant deux paramètres critiques, à savoir la teneur en mélanine et le nombre de mélanocytes. Alors que le premier est une lecture fonctionnelle commune émanant d’une réponse d’hypopigmentation, le second est associé à une réduction de la spécification ou de la survie des mélanocytes et est souvent associé à des conditions de dépigmentation génétique ou acquise. La stratégie globale de ce dépistage génétique inverse consiste à réduire au silence certains gènes à l’aide d’un morpholino et à étudier les résultats spécifiques aux mélanocytes. La teneur en mélanine est analysée à l’aide d’une quantification par image des valeurs moyennes de gris, suivie d’une confirmation à l’aide d’un test de teneur en mélanine. Le nombre de mélanocytes à différents stades de maturation est analysé à l’aide d’une quantification basée sur l’image et confirmé à l’aide de l’analyse FACS. Ici, le protocole de dépistage est démontré à l’aide de deux gènes candidats, à savoir l’anhydrase carbonique 14, impliquée dans la mélanogénèse, et une variante d’histones H2AFZ.2 impliquée dans la spécification des mélanocytes de la population précurseur de la crête neurale. Alors que le premier modifie la teneur en mélanine et non le nombre de mélanocytes, le second modifie le nombre de mélanocytes spécifiés et, par conséquent, la teneur en mélanine de l’embryon. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un protocole détaillé pour identifier le rôle d’un gène candidat dans la pigmentation et distinguer son rôle dans le contrôle du nombre de mélanocytes par rapport à la teneur en mélanine.
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Protocol
Les expériences sur le poisson zèbre ont été réalisées en stricte conformité avec l’approbation institutionnelle de l’éthique animale (IAEC) du CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), Inde (proposition n ° 45a). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale.
1. Injection de morpholino dans des embryons de poisson zèbre
- À l’aide d’un extracteur d’aiguille standard, tirez des pipettes très tranchantes et à bout fermé.
- Charger la solution contenant du morpholino dans les micropipettes à l’aide d’une pointe de microchargeur et l’insérer dans l’appareil de micro-injecteur. Serrez correctement la vis pour verrouiller la micropipette.
NOTE: La normalisation posologique des morpholinos est nécessaire. La posologie appropriée a un taux de survie de >70% et un phénotype spécifique à 24 hpf. - Coupez l’extrémité de la micropipette à l’aide d’une pince fine et étalonnez-la11.
- Pour étalonner, injecter 1 volume de solution morpholino dans le tube capillaire à partir de la micropipette, en maintenant le temps d’injection à 1 s. Répétez cette opération cinq fois. En utilisant la norme, 1 mm = 30 nL de volume, trouvez le volume injecté en 5 s en maintenant le tube capillaire contre une échelle de mesure. À l’aide des informations ci-dessus, calculer le temps (en secondes) nécessaire pour injecter 1 à 3 nL par injection12.
NOTE: La norme, 1 mm = 30 nL, est spécifique aux réglages de pression du micro-injecteur et au diamètre du capillaire utilisé pour l’étalonnage. Idéalement, l’injection doit être faite dans l’interface vitelline-cellule, qui se forme dans les 15-20 minutes après la fécondation. Pour faciliter les injections multiples, le développement peut être légèrement retardé en maintenant les embryons à une température plus basse (18 °C). Cependant, cela devrait être réduit au minimum et ne pas se prolonger au-delà de 30 minutes en raison de l’effet cumulatif de la température plus basse sur les changements d’expression génique. - Monter les embryons sur une boîte de Petri coulée à l’agarose (60 mm). Empiler les embryons étroitement dans les crêtes. À l’aide de pipettes en verre poli au feu, alignez-les dans la bonne orientation pour l’injection.
- Au microscope, utilisez des manipulateurs pour rapprocher la micropipette de l’embryon et injectez à l’intérieur de l’interface vitellin-cellule en appuyant sur la pédale de commande.
- Injecter tous les embryons de la même manière; les recueillir dans une boîte de Petri contenant de l’eau embryonnaire fraîche et les incuber à 28 °C.
- Vérifiez les embryons injectés après 6-8 h. Retirez tous les embryons morts identifiables en raison de leur grande opacité et continuez à changer l’eau de l’embryon au moins une fois par jour pour éviter l’infection.
2. Analyse de la pigmentation
- Préparation pour compter les mélanophores médians latéraux dans 3 embryons de poisson-zèbre dpf
- Traiter les embryons avec 0,016% d’anesthésique neuromusculaire pour les immobiliser.
- Pour monter les embryons pour l’imagerie, ajoutez quelques millilitres de méthylcellulose à 1,5-2% dans la boîte de Petri (60 mm) afin qu’elle forme une fine couche. À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever les embryons et les positionner doucement dans la méthylcellulose pour limiter tout mouvement ultérieur pendant l’imagerie.
- Ajustez leur position pour une imagerie latérale optimale (bande dorsale, bande ventrale, bande vitelline et mélanophores de la ligne médiane) ou dorsale (mélanophores sur la partie dorsale de la tête). Pour une meilleure résolution des mélanophores adjacents, image à un grossissement plus élevé (>5x)
- Imagerie en fond clair
REMARQUE: L’imagerie en fond clair est réalisée à l’aide d’un stéréomicroscope avec un grossissement de 8 à 10x.- Placez la boîte de Petri contenant les embryons de poisson zèbre au microscope. À l’aide d’un manipulateur, ajuster le poisson dans une telle orientation de manière à ce que les cinq bandes embryonnaires mélanocytaires soient visibles simultanément (dorsale, ventrale, deux latérales, vitelline) (figure 1C). Capturez rapidement des images à l’aide du logiciel d’acquisition. Dans le cas où l’animal retrouve son mouvement avant d’être imagée, le replonger dans un anesthésique et procéder à l’imagerie une fois qu’il est suffisamment immobilisé.
- Répétez cela avec tous les poissons et assurez-vous que le grossissement reste le même pour chaque image.
- Calcul de la valeur moyenne du gris à l’aide du logiciel ImageJ
- Prenez des images dorsales et latérales de 2 embryons de poisson-zèbre dpf.
- Ouvrez l’image à quantifier dans ImageJ à l’aide de l’outil Ouvrir . Utilisez l’outil de forme à main levée pour délimiter la zone à analyser. Accédez à l’option Définir les mesures et sélectionnez Valeur de gris moyenne | zone. Appuyez sur M (ou Analyser | Mesure) pour calculer la valeur moyenne de gris pour la zone sélectionnée.
- En gardant la zone à analyser constante, calculez la zone grise moyenne pour chaque animal séparément.
- Tracez un graphique à barres avec les données acquises (Figure 2F).
- Dosage de la mélanine
- À 2 dpf, utilisez une pipette Pasteur en verre pour prélever ~25 embryons de poisson zèbre.
- Effectuer la déchorionation manuelle à l’aide d’aiguilles à insuline de 1 mL et les ajouter à des tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL.
- Jeter soigneusement le milieu embryonnaire et ajouter 1 mL de tampon de lyse glacée (phosphate de sodium 20 mM (pH 6,8), 1% Triton X-100, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM) avec cocktail inhibiteur de protéase et préparer des lysats de protéines par sonication.
- Dissoudre les lysats dans 1 mL de 1 N NaOH et incuber les échantillons à 100 °C pendant 50 min au bain-marie. Vortex par intermittence pour homogénéiser complètement les lysats.
- Prendre des lectures d’absorbance des échantillons à 490 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Calculer la teneur en mélanine en comparant l’absorbance de l’échantillon à une courbe standard des concentrations connues de mélanine synthétique (Figure 2G).
3. Nombre de mélanophores
NOTE: L’analyse de fluorescence dans les embryons de poisson zèbre transgénique peut être effectuée par deux méthodes: 1) compter les cellules GFP positives; 2) mesurer l’intensité de fluorescence.
- Préparation pour le comptage basé sur FACS des cellules GFP positives chez les embryons précoces de poisson-zèbre
- Prélever 200 à 250 embryons ftyrp:GFP et les laver dans une passoire avec de l’eau d’embryon ordinaire. En tant que contrôle négatif, traiter les embryons de type sauvage (Assam Wildtype) à la GFP négative et appariésau stade 12.
- Selon le stade d’intérêt, transférer les embryons dans une boîte de Petri contenant 0,6 mg/mL de pronase. Après 5-10 min, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les embryons déchorionnés dans une boîte de Petri fraîche contenant de l’eau embryonnaire ordinaire. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever ~100 embryons et les transférer dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
- Jeter soigneusement le milieu et ajouter 200 μL de solution de Ringer glacée (tampon de dyolking). En gardant le tube sur la glace, pipeter le contenu de haut en bas ~ 20 fois jusqu’à ce que le jaune soit dissous. Centrifuger les tubes à 100 × g pendant 1 min dans une centrifugeuse de table à 4 °C. Centrifuger à nouveau et jeter soigneusement le surnageant.
- À l’aide d’une pipette de 1 mL, transférer les embryons éblouis dans une boîte de Pétri contenant 10 mL de solution de trypsine (tampon de dissociation cellulaire). Exécutez-le dans plusieurs boîtes de Petri pour éviter le surpeuplement des embryons et la trypsinisation inefficace. Utilisez une pipette de 1 mL, mélangez la solution contenant les corps embryonnaires une ou deux fois pour diminuer l’agrégation.
- Incuber les boîtes de Petri à température ambiante pendant 15 min (<24 embryons hpf) ou 30 min (24-30 hpf embryons). Aspirer et distribuer la suspension de temps en temps à l’aide d’une pipette de 1 mL pour faciliter la désintégration des cellules.
- Pendant la période d’incubation, initialisez l’appareil de cytomètre en flux pour le comptage cellulaire.
- Placer une crépine cellulaire de 70 μm au-dessus d’un tube conique de 50 ml et faire passer la suspension trypsinisée à travers la crépine pour obtenir une suspension unicellulaire. Lavez la vaisselle de Petri avec la même suspension plusieurs fois pour éliminer les cellules collées à la surface.
- Faire tourner les échantillons à 450 × g, 4 °C pendant 5 min dans un rotor de godet oscillant.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 ml de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS).
- Essorer à nouveau à 450 × g, 4 °C pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Enfin, remettre en suspension la pastille dans du PBS + 5% de sérum fœtal bovin et la garder sur la glace jusqu’à ce que le FACS fonctionne.
- Préparation du cytomètre en flux
- Allumez le cytomètre en flux et lancez le démarrage.
REMARQUE: Avant d’allumer la machine, videz la poubelle et remplissez le réservoir de liquide de la gaine. - Normaliser le débit du flux pour une buse de 70 μm (ou 85 μm). Laissez-le intact pendant 10-15 minutes s’il est instable.
- Allumez le cytomètre en flux et lancez le démarrage.
- Comptage de cellules marquées par fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux
- Initialisez un nouveau dossier d’expérience et créez un nuage de points de diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale et un histogramme de l’intensité de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
- Chargez d’abord les cellules de type sauvage pour régler les portes de dispersion avant et latérale (pour exclure les doublets et les débris) et le seuil FITC.
- Une fois les portes posées, retirez l’échantillon et chargez les cellules isolées des embryons Tg(ftyrp1:GFP) pour compter les mélanocytes.
REMARQUE: Ici, comme ftyrp1: GFP étiquette spécifiquement les mélanocytes matures, le nombre de cellules GFP-positives sous la porte FITC correspondra au nombre de mélanocytes. - Répétez l’étape ci-dessus avec des échantillons morpholino-injectés pour estimer et comparer le nombre de mélanocytes avec le témoin.
- Mesure de l’intensité de fluorescence chez les embryons de poisson zèbre
- À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever 100 à 120 embryons et les transférer dans une boîte de Petri contenant de l’eau d’embryon ordinaire.
- À ~10-12 hpf, transférer les embryons à 0,003% 1-phényl-2-thiourée pour inhiber la pigmentation.
- Effectuer une déchorionation manuelle à l’aide d’aiguilles à insuline pour l’imagerie d’embryons <48 hpf.
- Pour immobiliser les embryons, traitez-les avec 0,016% de tricaïne.
- Pour monter des embryons pour l’imagerie, mettez quelques mL de méthylcellulose à 1,5-2% dans la boîte de Petri (60 mm) afin qu’elle forme une fine couche. Ajouter les embryons à la méthylcellulose pour restreindre tout mouvement ultérieur pendant l’imagerie. Placez la boîte de Petri contenant les échantillons au microscope. À l’aide d’une pointe de pipette, ajustez l’animal dans l’orientation souhaitée.
- Acquérir des images à l’aide du logiciel d’acquisition. Pour les embryons <24 hpf, capturer l’embryon entier à la fois sous un grossissement de 10x. Pour >24 étages hpf, acquérir plusieurs champs de balayage et ensuite les assembler (coudre) ensemble.
- Répétez cette opération avec tous les poissons et assurez-vous que le réglage d’acquisition reste constant tout au long de l’expérience.
- Quantification
- Analysez davantage l’image à l’aide du logiciel ImageJ.
- Ouvrez l’image à quantifier dans ImageJ à l’aide de l’outil Ouvrir .
- Utilisez l’outil de forme à main levée pour délimiter la zone à analyser (Figure 3E).
- Appuyez sur M (ou Analyser | Mesure) pour acquérir une mesure de l’intensité de la zone sélectionnée .
- En gardant la zone à analyser constante, calculez l’intensité moyenne par zone pour chaque animal séparément.
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Representative Results
Le flux de travail décrit à la figure 1 a été utilisé pour effectuer une perturbation génétique basée sur le morpholino au stade unicellulaire du poisson zèbre. L’analyse de la pigmentation a été effectuée à l’aide de diverses méthodes, comme mentionné ci-dessous. Pour illustrer les résultats représentatifs, des volumes standardisés de morpholino antisens ciblant les gènes h2afv et ca14 ont été injectés dans le stade vitellin ou unicellulaire de l’embryon de poisson zèbre. Le phénotypage initial basé sur l’imagerie en fond clair a été effectué 48 heures après la fécondation (hpf), lorsque les cinq bandes mélanophores pigmentées (dorsale, ventrale, vitelline, deux latérales) étaient évidentes.
Les figures 2A,B représentent une approche pour analyser la pigmentation en calculant le nombre de mélanophores latéraux par embryon. Les mélanophores latéraux ont été comptés manuellement au stade 48 hpf en zoomant sur la région latérale du poisson-zèbre incliné. Une méthode alternative pour quantifier les mélanophores pigmentés (figure supplémentaire S1) consiste à compter manuellement les mélanophores de la tête en imageant la vue dorsale du poisson zèbre.
La teneur en mélanine par embryon est calculée en mesurant la valeur moyenne du gris, en maintenant la région d’intérêt constante à l’aide du logiciel ImageJ. La figure 2C-F montre que la valeur moyenne de gris des morphants ca14 et h2afv était plus élevée que chez les morphants témoins. Comme la valeur moyenne de gray est inversement proportionnelle à la teneur en mélanine, l’élimination des gènes ca14 et h2afv a entraîné une diminution de la teneur en mélanine par embryon. Une autre méthode robuste pour quantifier la teneur en mélanine est une méthode d’absorption spectrophotométrique basée sur NaOH. Comme le montre la figure 2G, la teneur totale en mélanine des morphants ca14 était inférieure à celle des morphants témoins.
L’imagerie fluorescente a révélé deux stades différents du développement des mélanophores du poisson zèbre : les mélanophores spécifiés précoces (mitfa:gfp) et les mélanophores différenciateurs (ftyrp:gfp). L’altération morpholino a été évaluée par imagerie fluorescente (Figure 3A et Figure 3C). Pour valider davantage ces observations, la fréquence des cellules GFP-positives a été calculée à l’aide de FACS. L’élimination de h2afv mais pas de ca14 a réduit significativement le nombre de mélanophores par rapport au contrôle (figure 3A-D). De plus, une réduction de l’intensité/surface moyenne de fluorescence peut être calculée à l’aide du logiciel ImageJ, en maintenant la région d’intérêt constante. Les morphants H2afv montrent une diminution significative de l’intensité/surface fluorescente moyenne par rapport aux morphants témoins (figure 3E,F).
Figure 1 : Flux de travail pour une approche génétique inverse visant à identifier les régulateurs de la biologie des mélanocytes à l’aide du poisson zèbre. (A) Organigramme illustrant le flux de travail expérimental depuis la micro-injection jusqu’à l’évaluation de la pigmentation par diverses méthodes. (B) Le porte-aiguille à microinjection et le micromanipulateur, ainsi qu’un microscope à dissection, sont une configuration typique pour la micro-injection d’embryons de poisson zèbre au stade unicellulaire. (C) Motif mélanocytaire embryonnaire chez le poisson zèbre à 3 dpf montrant les cinq bandes : dorsolatérale, deux lignes médianes latérales (pointues par quatre flèches rouges), bande ventrale et bande vitelline. (D) Pour étudier le résultat de la pigmentation lors de l’injection de morpholino, les mélanophores médians latéraux peuvent être comptés au stéréomicroscope. Image en fond clair d’une région dorsale à 2 dpf; La teneur en mélanine peut être quantifiée en mesurant la valeur moyenne de gris. (E) Les valeurs moyennes de gris sont inversement proportionnelles à la teneur en mélanine de l’embryon. Mélanophores remplis de mélanine à 2 dpf dans les embryons de type sauvage. (F) Un dosage de la mélanine peut être effectué pour estimer la production de mélanine dans ces mélanophores. Poisson zèbre transgénique marquant les cellules exprimant la protéine TYRP1 à 2 dpf. G) Les cellules marquées par fluorescence peuvent être quantifiées à l’aide de FACS; barre d’échelle = 100 μm. Poisson zèbre transgénique marquant les cellules exprimant la protéine Mitfa à 1 dpf. L’intensité moyenne de fluorescence par animal peut être mesurée à l’aide du logiciel ImageJ. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : dpf = jours après la fécondation; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comptage des mélanophores médians latéraux, mesure de la valeur moyenne de gris et dosage de la mélanine. Des images microscopiques en fond clair de la vue latérale des morphants ont été utilisées pour quantifier la teneur en mélanine à l’aide du logiciel ImageJ. A) Morphants témoins et variant Histone h2afv (h2afv) à 3 dpf; Sur la droite se trouvent les régions du tronc zoomées de ces embryons représentant le nombre de mélanocytes. (B) Le nombre de mélanophores dans les morphants h2afv est considérablement réduit par rapport au témoin, n > 10 chacun dans 3 réplications biologiques. (C) Image représentative des morphants témoins vs anhydrase carbonique 14 à 2 dpf. (D) Quantification de la mélanine de ca14 vs morphants témoins, n > 10 à travers 3 réplications biologiques. (E) Vue latérale des morphants h2afv vs témoins à 2 dpf. (F) Quantification de la teneur en mélanine des morphants h2afv vs témoins. Les rectangles rouges représentent le retour sur investissement choisi pour l’analyse basée sur ImageJ. (G) Dosage de la mélanine effectué sur des embryons morpholino-injectés pour quantifier la teneur totale en mélanine. Moyenne de trois expériences indépendantes ± SEM.; **P < 0,01, **** P < 0,0001. Test t de l’étudiant; les barres d’erreur sont la moyenne ±'erreur-type de la moyenne (MEB). Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : MO = morpholino; DPF = jours après la fécondation; ROI = région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Quantification des cellules marquées par fluorescence à l’aide de FACS et mesure de l’intensité moyenne de fluorescence. (A) Images de fluorescence d’embryons morphants ca14 et témoins à 2 dpf de la lignée Tg (ftyrp1: GFP), où les mélanocytes différenciateurs sont marqués par l’expression de GFP. (B) Le nombre de mélanophores dans le ca14 et les embryons morphants témoins à 2 dpf restent inchangés, n = 3 réplications biologiques. (C) Images de fluorescence à 2 dpf de h2afv et morphants témoins de la raie Tg(ftyrp1:GFP). (D) Le nombre de mélanophores dans les morphants h2afv est significativement réduit par rapport aux embryons morphants témoins à 2 dpf, n = 3 réplications biologiques. (E) Images de fluorescence d’embryons témoins et morphants h2afv à 36 hpf de Tg(mitfa:GFP) avec des mélanocytes marqués. (F) L’IFM par animal est calculée à l’aide du logiciel ImageJ et représentée sous la forme d’un graphique à barres illustrant des ensembles de données individuels. L’IMF est significativement réduite dans les morphants h2afv par rapport au contrôle. Le rectangle rouge représente le retour sur investissement choisi pour l’analyse logicielle ImageJ. n = 3 réplications biologiques; P < 0,001, ****P < 0,0001. Test t de l’étudiant; les barres d’erreur sont la moyenne ± l’erreur-type de la moyenne (MEB); barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : MO = morpholino; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; GFP = protéine fluorescente verte; DPF = jours après la fécondation; ROI = région d’intérêt; MFI = intensité moyenne de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Quantification des mélanophores de tête. (A) Vue dorsale de h2afv et de morphants témoins à 48 hpf montrant des mélanophores de tête. La case rouge représente le retour sur investissement. En gardant la zone d’intérêt constante, le nombre de mélanophores de tête peut être quantifié manuellement. (B) Nombre de mélanophores de tête significativement réduit lors de l’élimination de h2afv. Les barres représentent la moyenne géométrique avec IC à 95% du nombre de mélanophores têtes par embryon avec >30 embryons chacun. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : MO = morpholino; IC = intervalle de confiance; HPF = heures après la fécondation; ROI = région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Microréseau de mélanocytes primaires humains traités par PTU. La carte thermique montre l’expression des gènes de pigmentation (mitf, tyrosinase, dct, mc1r) lors du traitement dans les mélanocytes primaires humains. Abréviations : PTU = 1-phényl-2-thiourée; tyr = tyrosinase. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le phénotype de pigmentation se manifeste souvent par des altérations de la teneur en mélanine ou du nombre de mélanocytes pigmentaires. La méthode décrite ici permet la dissection de cette dichotomie et permet une évaluation qualitative et quantitative de la teneur en mélanine et du nombre de mélanophores par embryon, quelle que soit la teneur en mélanine. La fécondité élevée du poisson zèbre, la nature visible des mélanocytes pigmentés et l’absence de transfert de mélanosomes permettent la dissection de la biologie des mélanocytes en utilisant cette approche génétique inverse qui se prête à un criblage à débit moyen.
Le choix du silençage à base de morpholino émane de la facilité de silençage et de la possibilité de tester plusieurs candidats en parallèle. L’utilisation d’une approche de silençage à base de morpholino présente certaines limites, et des lignes directrices pour l’utilisation et l’interprétation de ces outils précieux ont été décrites précédemment13. Essentiellement, la validation du phénotype lors de l’élimination à l’aide de plusieurs OM fournit une solution tangible à ce problème. Une autre stratégie consiste à utiliser la perturbation génétique basée sur CRISPR. La pénétrance du phénotype est limitée en raison de la fréquence intrinsèquement plus faible des événements génétiques et pourrait être aggravée par des mutations hétérogènes. Cela limite son utilisation pour le dépistage génétique inverse14.
L’évaluation phénotypique des perturbations sélectives des mélanocytes entraîne souvent une diminution de la teneur en pigments en raison d’une réponse mélanogène altérée. Cependant, il existe plusieurs gènes qui perturbent la spécification des mélanocytes et provoquent donc une réduction de la pigmentation due à une diminution du nombre global de mélanocytes. Une dissection systématique des deux scénarios est essentielle pour attribuer la fonction moléculaire du gène dans la pigmentation. La mesure de la teneur en mélanine est aggravée par la nature complexe du polymère de mélanine. Parmi les deux méthodes disponibles, à savoir la solubilisation de la mélanine par NaOH et la détection par CLHP des produits stables d’oxydation de la mélanine acide 1H-pyrrole-2,3,5-tricarboxylique et acide pyrrole-2,3-dicarboxylique, la première méthode peut être réalisée en routine en laboratoire tandis que la seconde nécessite des normes spécifiques et une instrumentation sophistiquée15.
De plus, le nombre d’embryons requis par la méthode NaOH est également plus élevé en raison de plusieurs étapes impliquées dans la détection. L’hydrolyse à base de NaOH solubilise la mélanine et permet la quantification spectrophotométrique. Bien que cette méthode soit robuste et puisse être adoptée pour un criblage à débit moyen (10 à 15 candidats à la fois), la xanthine présente dans les xanthophores est une substance interférente potentielle en raison de son absorption inhérente dans la gamme 400-450 nm16. Par conséquent, une concordance entre la détermination de la valeur grise moyenne basée sur l’analyse d’images et le test de la teneur en mélanine doit être effectuée pour confirmer la réduction de la teneur en mélanine.
Le PTU offre un outil facile pour réduire la pigmentation et visualiser l’embryon autrement transparent. L’utilisation pourrait éventuellement entraîner des changements de rétroaction et invoquer des altérations dans les mélanocytes. Cependant, nous avons observé des changements minimes dans l’expression des gènes de pigmentation (figure supplémentaire S2).
Le comptage des mélanocytes est plus facile dans la ligne médiane latérale et la région de la tête, car les mélanocytes sont relativement distinctement observables dans ces régions (Figure supplémentaire S1). Les mélanophores de ligne latérale proviennent de la population de cellules souches mélanocytaires qui réside près des ganglions de la racine dorsale18. L’imagerie de cette population présente plusieurs avantages tels qu’un nombre fixe par embryon et une distinction claire. Cependant, les deux lignes controlatérales doivent être imagées en inclinant légèrement l’embryon; sinon, les deux fusionnent en raison de la nature transparente de l’embryon, ce qui le rend difficile à compter (Figure 1C versus Figure 2C).
Les mélanophores du poisson zèbre sont distincts des cellules pigmentées de l’œil qui sont dérivées du neuro-ectoderme. Ceux-ci se distinguent par leur positionnement dans l’embryon et sont évidents dans l’œil par rapport au motif du corps. Dans l’expérience basée sur FACS, les cellules dérivées de l’œil peuvent être distinguées par leur taille car elles sont significativement plus petites que les mélanophores et peuvent être fermées en utilisant des critères de taille ou de dispersion.
Les estimations des mélanocytes à différents stades de maturation à l’aide de lignées transgéniques sont facilement réalisées à l’aide d’une quantification basée sur l’image. La quantification du nombre de mélanophores en ligne latérale est robuste car leur nombre varie dans une fenêtre comprise entre 2 dpf et 5 dpf de chaque côté de l’embryon17. Cependant, le nombre de mélanophores en ligne latérale est déterminé par la migration et l’établissement d’un pool de cellules souches associées au ganglion de la racine dorsale18. Par conséquent, toute modification de ces processus peut conduire à une observation similaire. Pour contourner ce facteur de confusion, l’estimation basée sur FACS de tous les mélanophores est une solution tangible.
Alternativement, la quantification des mélanophores de tête peut être effectuée comme indiqué dans la figure supplémentaire S1 comme substitut pour le nombre de mélanophores . Il est intéressant de noter que les altérations des niveaux d’équilibre du nombre de mélanocytes pourraient signifier deux fonctions opposées pour le gène candidat en question. Il pourrait soit entraîner une diminution de la spécification des mélanocytes à partir des précurseurs de la crête neurale, soit causer la mort spécifique des mélanocytes et doit être traité en utilisant des méthodes telles que le test en tunnel. Des variations telles que les micro-injections suivies d’une imagerie de cellules vivantes permettraient de surveiller d’autres phénotypes spécifiques aux mélanocytes tels que la migration et la structuration. Les chercheurs sur les cellules pigmentaires seraient intéressés par le processus de transfert des mélanosomes, qui n’est pas opérationnel dans le système des poissons. Cependant, le mouvement concerté des mélanosomes dans les mélanophores peut être étudié avec des altérations dans l’imagerie des cellules vivantes décrites ici avec des modifications. Dans l’ensemble, le protocole détaillé présenté dans cet article vidéo permettrait aux chercheurs en biologie des cellules pigmentaires d’interroger les gènes candidats et d’évaluer leur rôle dans la biologie des mélanocytes.
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Disclosures
Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions le projet MLP2008 et le Département des sciences et de la technologie pour le soutien financier du projet GAP165 pour le soutien financier du projet MLP2008 pour le soutien financier du projet présenté dans ce manuscrit. Nous remercions Jeyashri Rengaraju et Chetan Mishra pour leur aide dans les expériences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-A | For preparing MO solution |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-200-C | For washing steps in FACS protocol |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A-9539-500G | For microinjection |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | NA | For cell sorting |
| Capillary tube | Drummond | 1-000-0010 | |
| Corning cell strainer | Corning | CLS431751 | For making single cell suspension |
| DMEM High Glucose Media | Sigma-Aldrich | D5648 | FACS protocol |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521-50G | to immobilize ZF for imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | For cold lysis buffer |
| FACS tubes | BD-Biosciences | 342065 | FACS protocol |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10270 | FACS protocol |
| Graphpad prism Software | Graphstats Technologies | NA | For data representation |
| ImageJ Software | National Institute of health | NA | For image analysis |
| Insulin Syringes (1 mL) | DispoVan | NA | For manual dechorionation |
| Melanin, Synthetic | Sigma-Aldrich | M8631 | For melanin content assay |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7027-250G | to immobilize ZF for imaging |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For microinjection |
| Morpholino | Gene-tools | NA | For knock-down experiments |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | to inhibit melanin formation |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | For microinjection |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | FACS protocol |
| Petridish (60 mm) | Tarsons | 460090 | For embryo plates |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 10837091001 | For cold lysis buffer |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TL1099-500mL | For washing cells |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 53702 | For dechorionation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For cold lysis buffer |
| Sheath fluid | BD FACSFlowTM | 342003 | FACS protocol |
| Sodium phosphate | Merck | 7558-79-4 | Cold lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | For cold lysis buffer |
| TrypLE | Gibco | 1677119 | For trypsinization |
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