تطوير مختبر متنقل لفسيولوجيا الميتوكوندريا لقياس طاقة الميتوكوندريا في الميدان
Summary
قمنا بتصميم وبناء مختبر متنقل لقياس معدلات التنفس في الميتوكوندريا المعزولة للحيوانات البرية التي تم التقاطها في المواقع الميدانية. هنا ، نصف تصميم وتجهيز مختبر الميتوكوندريا المتنقل وبروتوكولات المختبر المرتبطة به.
Abstract
تعد طاقة الميتوكوندريا موضوعا مركزيا في الكيمياء الحيوية الحيوانية وعلم وظائف الأعضاء ، حيث يستخدم الباحثون تنفس الميتوكوندريا كمقياس للتحقيق في القدرة الأيضية. للحصول على مقاييس التنفس الميتوكوندريا ، يجب استخدام عينات بيولوجية جديدة ، ويجب إكمال الإجراء المختبري بأكمله في غضون 2 ساعة تقريبا. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى قطع متعددة من المعدات المتخصصة لإجراء هذه المقايسات المختبرية. وهذا يخلق تحديا لقياس تنفس الميتوكوندريا في أنسجة الحيوانات البرية التي تعيش بعيدا عن مختبرات علم وظائف الأعضاء حيث لا يمكن الحفاظ على الأنسجة الحية لفترة طويلة جدا بعد جمعها في الحقل. علاوة على ذلك ، فإن نقل الحيوانات الحية لمسافات طويلة يؤدي إلى الإجهاد ، والذي يمكن أن يغير طاقة الميتوكوندريا.
تقدم هذه المخطوطة MitoMobile بجامعة أوبورن (AU) ، وهو مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الذي يمكن نقله إلى الميدان واستخدامه في الموقع لقياس استقلاب الميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات البرية. يتم تقديم السمات الأساسية للمختبر المتنقل والطرق خطوة بخطوة لقياس معدلات التنفس الميتوكوندريا المعزولة. بالإضافة إلى ذلك ، تؤكد البيانات المقدمة نجاح تجهيز مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل وإجراء قياسات تنفس الميتوكوندريا. تكمن حداثة المختبر المتنقل في القدرة على القيادة إلى الميدان وإجراء قياسات الميتوكوندريا على أنسجة الحيوانات التي تم التقاطها في الموقع.
Introduction
حتى الآن ، اقتصرت الدراسات المصممة لقياس طاقة الميتوكوندريا على المختبر أو الحيوانات التي تم التقاطها بالقرب من مختبرات علم وظائف الأعضاء الراسخة ، مما منع العلماء من إجراء دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الأنسجة التي تم جمعها من الحيوانات خلال أنشطة مثل الهجرة والغوص والسبات1،2،3،4،5،6. في حين نجح العديد من الباحثين في قياس معدلات الأيض القاعدية والذروة ونفقات الطاقة اليومية للحيوانات البرية 7,8 ، ظلت قدرة الباحثين على قياس أداء الميتوكوندريا محدودة (ولكن انظر1،4،9). ويرجع ذلك جزئيا إلى الحاجة إلى أنسجة جديدة لعزل الميتوكوندريا ومنشأة مختبرية لإجراء عمليات العزل في غضون حوالي 2 ساعة من الحصول على الأنسجة الطازجة. بمجرد عزل الميتوكوندريا ، يجب أيضا إكمال قياسات تنفس الميتوكوندريا في غضون ~ 1 ساعة.
عادة ما يتم إجراء معدلات تنفس الميتوكوندريا المعزولة عن طريق قياس تركيز الأكسجين في حاوية محكمة الغلق متصلة بقطب كلارك. تستند النظرية الكامنة وراء هذه الطريقة إلى الملاحظة الأساسية القائلة بأن الأكسجين هو آخر مستقبل إلكتروني لتنفس الميتوكوندريا أثناء الفسفرة التأكسدية. لذلك ، مع انخفاض تركيز الأكسجين أثناء التجربة ، يفترض أن إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) يحدث10. الأكسجين المستهلك هو وكيل ل ATP المنتج. يمكن للباحثين إنشاء ظروف تجريبية محددة باستخدام ركائز مختلفة وبدء التنفس المستحث بالأدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) (الحالة 3) عن طريق إضافة كميات محددة مسبقا من ADP إلى الغرفة. بعد فسفرة جزيء ADP الخارجي إلى جزيء ATP ، ينخفض معدل استهلاك الأكسجين ، ويتم الوصول إلى الحالة 4 ويمكن قياسها. علاوة على ذلك ، تسمح إضافة مثبطات محددة بالحصول على معلومات تتعلق بالتنفس المتسرب والتنفس غير المنفصل10. تحدد نسبة الحالة 3 إلى الحالة 4 نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) ، وهي مؤشر اقتران الميتوكوندريا الكلي10,11. تشير القيم المنخفضة ل RCR إلى خلل وظيفي عام في الميتوكوندريا ، بينما تشير قيم RCR الأعلى إلى مدى أكبر من اقتران الميتوكوندريا10.
كما ذكرنا سابقا ، يجب إكمال جمع المواد البيولوجية وعزل الميتوكوندريا وقياس معدلات التنفس في غضون 2 ساعة من الحصول على الأنسجة. لإنجاز هذه المهمة دون نقل الحيوانات لمسافات كبيرة إلى المختبرات القائمة ، تم بناء مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل ليتم نقله إلى المواقع الميدانية حيث يمكن جمع هذه البيانات. تم تحويل مركبة ترفيهية Jayco Redhawk 2018 إلى مختبر فسيولوجيا جزيئية متنقل وسميت جامعة أوبورن (AU) MitoMobile (الشكل 1A). تم اختيار مركبة ترفيهية بسبب الثلاجة المدمجة والفريزر وخزان تخزين المياه والسباكة والكهرباء التي تعمل ببطاريات 12 فولت ومولد الغاز وخزان البروبان ونظام التسوية الذاتية. علاوة على ذلك ، توفر السيارة الترفيهية القدرة على البقاء في المواقع النائية طوال الليل لجمع البيانات. لم يتم تغيير مقدمة السيارة وتوفر أماكن القيادة والنوم (الشكل 1 ب). تمت إزالة وسائل الراحة المثبتة مسبقا في غرفة النوم (السرير والتلفزيون والخزانة) في الجزء الخلفي من السيارة والموقد.
تم تركيب أرفف مصنوعة حسب الطلب من الفولاذ المقاوم للصدأ وسطح عمل كوارتز مخصص مدعوم بإطار من الألومنيوم 80/20 بدلا من وسائل الراحة في غرفة النوم والموقد (الشكل 1C). توفر مقاعد المختبر مساحة كافية لجمع البيانات (الشكل 1 د). وأخذ في الاعتبار استهلاك الطاقة لكل قطعة من المعدات (أي أجهزة الطرد المركزي المبردة، وغرف التنفس الميتوكوندريا، وأجهزة قراءة الألواح، والحواسيب، والمجانسات، والموازين، والمجمدات الفائقة المحمولة، وغيرها من لوازم المختبرات العامة). لدعم الجهد الكبير ومتطلبات التيار لأجهزة الطرد المركزي ، تمت ترقية النظام الكهربائي إلى معدات الطائرات. تم تحويل حجرة خارجية في الجزء الخلفي من السيارة إلى حجرة لتخزين النيتروجين السائل ، والتي تلبي إرشادات وزارة النقل الأمريكية لتخزين النيتروجين السائل ونقله. تم بناء وحدة التخزين هذه من الفولاذ المقاوم للصدأ ولها تهوية مناسبة لمنع أي غاز نيتروجين متمدد من التسرب إلى مقصورة الركاب في السيارة.
للتأكد من إمكانية استخدام المختبر المتنقل في دراسات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ، تم عزل الميتوكوندريا ، وتم قياس معدلات تنفس الميتوكوندريا من الفئران المنزلية المشتقة من البرية (Mus musculus) العضلات الهيكلية الخلفية. نظرا لأن Mus musculus هو كائن نموذجي ، فإن معدلات تنفس الميتوكوندريا لهذا النوع راسخة12،13،14. على الرغم من أن الدراسات السابقة قد وثقت عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي15،16،17 ، إلا أنه تم وصف لمحة موجزة عن الطرق المستخدمة في طرق مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقلة أدناه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن مختبر فسيولوجيا الميتوكوندريا المتنقل الباحثين من عزل الميتوكوندريا وقياس معدلات تنفس الميتوكوندريا في غضون 2 ساعة من جمع الأنسجة في المواقع الميدانية النائية. تشير النتائج المقدمة هنا إلى أن قياسات تنفس الميتوكوندريا التي أجريت في AU MitoMobile قابلة للمقارنة مع القياسات التي أجريت في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بمارك نيلمز وجون تينانت من قسم الهندسة الكهربائية وهندسة الحاسبات في كلية صموئيل جين للهندسة بجامعة أوبورن للمساعدة في التجهيز الهيكلي والكهربائي ل AU MitoMobile. بالإضافة إلى ذلك ، يقر المؤلفون بالتمويل لتجهيز AU MitoMobile والبحث من منحة الجوائز الرئاسية بجامعة أوبورن للبحوث متعددة التخصصات (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
