우리는 현장에서 포획한 야생 동물의 고립된 미토콘드리아에서 호흡수를 측정하기 위해 이동식 실험실을 설계하고 건설했습니다. 여기에서는 이동식 미토콘드리아 실험실의 설계 및 의장과 관련 실험실 프로토콜에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아 에너지학은 동물 생화학 및 생리학의 중심 주제이며, 연구자들은 미토콘드리아 호흡을 대사 능력을 조사하기 위한 지표로 사용합니다. 미토콘드리아 호흡 측정값을 얻으려면 신선한 생물학적 샘플을 사용해야 하며 전체 실험실 절차는 약 2시간 이내에 완료되어야 합니다. 또한 이러한 실험실 분석을 수행하려면 여러 특수 장비가 필요합니다. 이로 인해 생리학 실험실에서 멀리 떨어진 야생 동물의 조직에서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 어려움이 있는데, 이는 살아있는 조직이 현장에서 수집된 후 오랫동안 보존될 수 없기 때문입니다. 또한 살아있는 동물을 장거리로 운송하는 것은 스트레스를 유발하여 미토콘드리아 에너지를 변화시킬 수 있습니다.
이 원고는 야생 동물에서 채취한 조직의 미토콘드리아 대사를 측정하기 위해 현장에서 사용할 수 있는 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실인 Auburn University(AU)의 MitoMobile을 소개합니다. 이동식 실험실의 기본 기능과 격리된 미토콘드리아 호흡수를 측정하기 위한 단계별 방법이 제시됩니다. 또한 제시된 데이터는 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 갖추고 미토콘드리아 호흡 측정을 수행하는 것이 성공적이었음을 입증합니다. 이동식 실험실의 참신함은 현장으로 운전하여 현장에서 포획한 동물의 조직에 대한 미토콘드리아 측정을 수행할 수 있는 능력에 있습니다.
서론
현재까지 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위해 고안된 연구는 실험실 동물 또는 기존 생리학 실험실 근처에서 포획한 동물로 제한되어 과학자들이 이동, 잠수 및 동면과 같은 활동 중에 동물로부터 수집한 조직에서 미토콘드리아 생체 에너지 연구를 수행하는 것을 배제했습니다 1,2,3,4,5,6 . 많은 연구자들이 야생동물의 기초 및 최대 대사율과 일일 에너지 소비량을 성공적으로 측정했지만(7,8), 미토콘드리아의 성능을 측정하는 연구자들의 능력은 여전히 제한되어 있다(1,4,9 참조). 이는 부분적으로 미토콘드리아를 분리하기 위한 신선한 조직과 신선한 조직을 얻은 후 약 2시간 이내....
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프로토콜
다음 섹션에서는 미토콘드리아 실험실 방법에 대해 설명합니다. 모든 동물 취급 및 조직 수집 절차는 Auburn University Institutional Animal Care and Use Committee(#2019-3582)의 승인을 받았습니다.
1. 데이터 수집에 사용되는 버퍼에 대한 설명
참고: 이 완충액은 고정식 실험실에서 준비하고 현장 학습 전에 이동식 실험실로 이동할 수 있습니다(아래에 달리 명시되지 않는 한).
- 표 1에서 볼 수 있듯이 소 혈청 알부민(BSA)으로 골격근 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다.
- 지방산이 없는 BSA를 제외한 탈이온수(~ 90% 부피)에 화학 물질을 녹입니다. 온도가 4 °C가 될 때까지 버퍼를 냉장고에 넣으십시오.
- 온도를 7.5°C로 유지하면서 용액을 pH 4로 조정합니다.
- 무지방산 BSA를 첨가하고 부피를 100%로 올립니다. 용액을 50mL 코니컬 튜브에 분취합니다. 이 용액을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
- 표 1에서 볼 수 있듯이 ....
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결과
본 논문은 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실에서 야생 유래 Mus musculus(n=7, 수컷=5, 암컷=2, 나이=1.30± 0.2세)의 미토콘드리아 호흡을 조사했습니다(그림 1). 골격근 미토콘드리아 호흡을 측정하기 위해 뒷다리 전체, 즉 유산소 및 혐기성 근육을 미토콘드리아 분리에 사용했습니다(그림 2). 원시 미토콘드리아 호흡 데이터의 예는 그림 3에 나와 있습니다. 그림 3A와 그림 3B는 복잡한 I 구동 미토콘드리아 호흡을 나타냅니다. 그림 3A에서 관찰된 가파른 경사는 높은 최대 호흡수를 나타냅니다. 이 값은 추가 데이터 분석에 사용됩니다. 뒷다리 골격근에서 미토콘드리아를 성공적으로.......
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토론
이동식 미토콘드리아 생리학 실험실을 통해 연구원들은 미토콘드리아를 분리하고 원격 현장 현장에서 조직 채취 후 2시간 이내에 미토콘드리아 호흡수를 측정할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 AU MitoMobile에서 수행된 미토콘드리아 호흡의 측정이 대학 연구 실험실에서 수행된 측정과 유사하다는 것을 시사합니다. 구체적으로, 여기에 제시된 야생 유래 Mus musculus에 대한 상태 3, 상태 4 및 RCR의 값은 동일한 실험실 및 다른 실험실에서 이전에 발표된 결과와 비교할 수 있습니다(표 3)12,23. 그러나 사용된 마우스 균주와 방법이 다르기 때문에 이러한 연구를 직접 비교할 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 결과는 이 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실에서 미토콘드리아 호흡 측정에 대한 개념 증명을 보여줍니다.
미.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 AU MitoMobile의 구조 및 전기 의장을 지원한 Auburn University의 Samuel Ginn College of Engineering의 전기 및 컴퓨터 공학과의 Mark Nelms와 John Tennant에게 감사를 표합니다. 또한 저자는 AU MitoMobile을 꾸미기 위한 자금과 Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research(PAIR) 보조금의 연구를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 원심분리기 튜브 | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL 원심분리기 튜브 | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge 원심분리기 튜브 |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| 투명 96 웰 플레이트 | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce 균질화 VWR | 22877-284 | Corning | |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Hansatech | OxyGraph에 포함 | ||
| 유리 지방산 BSA VWR | 89423-672 | ||
| 포도 | VWR | BDH8005-500G | |
| 글루타메이트 | VWR | A12919 | |
| 해밀턴 주사기 | VWR | 60373-985 | 가스라이트 1700 시리즈 주사기 |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | 카탈로그 번호는 없지만 제품 아래에서 찾을 수 있습니다 --> 전극 제어 장치 | |
| KH2PO4 VWR | 97062-350 | ||
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | 포함 Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| 염화칼륨 (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| 프로테아제 | VWR | 97062-366 | 트립신이 일반적으로 사용되지만 다른 프로테아제를 사용할 수 있습니다. |
| 피루브산 | VWR | 97061-448 | |
| 나트륨 디티오나이트 | VWR | AA33381-22 | |
| 숙시네이트 | VWR | 89230-086 | |
| 자당 | VWR | BDH0308-500G | |
| 트리스 베이스 | VWR | 97061-794 | |
| 트리스 -HCl | VWR | 97061-258 |
참고문헌
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K.
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재인쇄 및 허가
