Entwicklung eines mobilen Labors für mitochondriale Physiologie zur Messung der mitochondrialen Energetik im Feld
Summary
Wir haben ein mobiles Labor entworfen und gebaut, um die Atmungsraten in isolierten Mitochondrien von Wildtieren zu messen, die an Feldstandorten gefangen wurden. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Ausstattung eines mobilen mitochondrialen Labors und die dazugehörigen Laborprotokolle.
Abstract
Die mitochondriale Energetik ist ein zentrales Thema in der Biochemie und Physiologie von Tieren, wobei Forscher die mitochondriale Atmung als Metrik verwenden, um die Stoffwechselfähigkeit zu untersuchen. Um die Messungen der mitochondrialen Atmung zu erhalten, müssen frische biologische Proben verwendet werden, und das gesamte Laborverfahren muss innerhalb von ca. 2 h abgeschlossen sein. Darüber hinaus sind mehrere Spezialgeräte erforderlich, um diese Labortests durchzuführen. Dies stellt eine Herausforderung für die Messung der mitochondrialen Atmung in den Geweben von Wildtieren dar, die weit entfernt von physiologischen Labors leben, da lebendes Gewebe nach der Entnahme im Feld nicht sehr lange konserviert werden kann. Darüber hinaus führt der Transport lebender Tiere über große Entfernungen zu Stress, der die Energetik der Mitochondrien verändern kann.
Dieses Manuskript stellt das MitoMobile der Auburn University (AU) vor, ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie, das vor Ort zur Messung des mitochondrialen Stoffwechsels in Geweben von Wildtieren eingesetzt werden kann. Die Grundzüge des mobilen Labors und die Schritt-für-Schritt-Methoden zur Messung isolierter mitochondrialer Atmungsraten werden vorgestellt. Darüber hinaus bestätigen die präsentierten Daten den Erfolg der Ausstattung des mobilen Labors für mitochondriale Physiologie und der Durchführung von Messungen der mitochondrialen Atmung. Die Neuheit des mobilen Labors liegt in der Möglichkeit, zum Feld zu fahren und mitochondriale Messungen an den Geweben von Tieren durchzuführen, die vor Ort gefangen wurden.
Introduction
Bisher waren Studien zur Messung der mitochondrialen Energetik auf Labortiere oder Tiere beschränkt, die in der Nähe etablierter Physiologielabors gefangen wurden, was Wissenschaftler daran hinderte, mitochondriale bioenergetische Studien an Geweben durchzuführen, die von Tieren während Aktivitäten wie Migration, Tauchen und Winterschlaf gesammelt wurden 1,2,3,4,5,6 . Während viele Forscher erfolgreich die Grund- und Spitzenumsatzraten und den täglichen Energieverbrauch von Wildtieren gemessen haben7,8, ist die Fähigkeit der Forscher, die Leistung der Mitochondrien zu messen, begrenzt geblieben (sieheaber 1,4,9). Dies ist zum Teil auf den Bedarf an frischem Gewebe zur Isolierung von Mitochondrien und einer Laboreinrichtung zurückzuführen, um die Isolierungen innerhalb von etwa 2 Stunden nach der Gewinnung des frischen Gewebes durchzuführen. Sobald die Mitochondrien isoliert wurden, sollten auch die mitochondrialen Atmungsmessungen innerhalb von ~1 h abgeschlossen sein.
Isolierte mitochondriale Atmungsraten werden in der Regel durch Messung der Sauerstoffkonzentration in einem versiegelten Behälter durchgeführt, der mit einer Clark-Elektrode verbunden ist. Die Theorie hinter dieser Methode basiert auf der grundlegenden Beobachtung, dass Sauerstoff der letzte Elektronenakzeptor der mitochondrialen Atmung während der oxidativen Phosphorylierung ist. Wenn die Sauerstoffkonzentration während eines Experiments sinkt, wird daher angenommen, dass die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) stattfindet10. Der verbrauchte Sauerstoff ist ein Proxy für das produzierte ATP. Die Forscher können mit verschiedenen Substraten spezifische Versuchsbedingungen schaffen und eine Adenosindiphosphat (ADP)-stimulierte Atmung (Zustand 3) einleiten, indem sie der Kammer vorgegebene Mengen an ADP hinzufügen. Nach der Phosphorylierung des exogenen ADP zu ATP sinkt die Sauerstoffverbrauchsrate und der Zustand 4 ist erreicht und kann gemessen werden. Darüber hinaus können durch die Zugabe spezifischer Inhibitoren Informationen über die Leckatmung und die entkoppelte Atmung gewonnen werden10. Das Verhältnis von Zustand 3 zu Zustand 4 bestimmt das Atmungskontrollverhältnis (RCR), das der Indikator für die gesamte mitochondriale Kopplung ist10,11. Niedrigere RCR-Werte deuten auf eine allgemeine mitochondriale Dysfunktion hin, während höhere RCR-Werte auf ein größeres Ausmaß der mitochondrialen Kopplung hindeuten10.
Wie bereits erwähnt, müssen die Entnahme von biologischem Material, die mitochondriale Isolierung und die Messung der Atemfrequenz innerhalb von 2 Stunden nach der Gewebeentnahme abgeschlossen sein. Um diese Aufgabe zu erfüllen, ohne die Tiere über große Entfernungen in etablierte Labore zu transportieren, wurde ein mobiles Labor für mitochondriale Physiologie gebaut, das an Feldorte gebracht wird, an denen diese Daten gesammelt werden können. Ein Freizeitfahrzeug des Typs Jayco Redhawk aus dem Jahr 2018 wurde in ein mobiles Labor für molekulare Physiologie umgewandelt und auf den Namen MitoMobile der Auburn University (AU) getauft (Abbildung 1A). Ein Freizeitfahrzeug wurde aufgrund des eingebauten Kühlschranks, des Gefrierschranks, des Wasserspeichers und der Sanitäranlagen, des Stroms mit 12-Volt-Batterien, des Gasgenerators, des Propangastanks und des Selbstnivellierungssystems ausgewählt. Darüber hinaus bietet das Freizeitfahrzeug die Möglichkeit, über Nacht an abgelegenen Standorten zu bleiben, um Daten zu sammeln. Die Front des Fahrzeugs wurde nicht verändert und dient als Fahrer- und Schlafraum (Bild 1B). Zuvor installierte Schlafzimmerausstattungen (Bett, Fernseher und Schrank) im Heck des Fahrzeugs und auf dem Herd wurden entfernt.
Anstelle der Schlafzimmerausstattung und des Herds wurden maßgefertigte Edelstahlregale und eine maßgefertigte Quarz-Arbeitsplatte installiert, die von einem 80/20-Aluminiumrahmen getragen wird (Abbildung 1C). Die Labortische bieten ausreichend Platz für die Datenerfassung (Abbildung 1D). Der Stromverbrauch der einzelnen Geräte (d. h. gekühlte Zentrifugen, mitochondriale Atmungskammern, Plattenleser, Computer, Homogenisatoren, Waagen, tragbare Ultrafroster und andere allgemeine Labormaterialien) wurde berücksichtigt. Um den hohen Spannungs- und Stromanforderungen der Zentrifuge gerecht zu werden, wurde das elektrische System auf das von Flugzeuggeräten aufgerüstet. Ein externes Fach im Heck des Fahrzeugs wurde zu einer Lagerbucht für flüssigen Stickstoff umgebaut, die den Richtlinien des US-Verkehrsministeriums für die Lagerung und den Transport von flüssigem Stickstoff entspricht. Dieser Speicher wurde aus Edelstahl gefertigt und verfügt über eine entsprechende Entlüftung, um zu verhindern, dass sich ausdehnendes Stickstoffgas in den Fahrgastraum des Fahrzeugs gelangt.
Um zu bestätigen, dass das mobile Labor in mitochondrialen bioenergetischen Studien eingesetzt werden kann, wurden Mitochondrien isoliert und mitochondriale Atmungsraten von wild gewonnenen Hausmäusen (Mus musculus) des Skelettmuskels der hinteren Gliedmaßen gemessen. Da Mus musculus ein Modellorganismus ist, sind die mitochondrialen Atmungsraten dieser Spezies gut etabliert12,13,14. Obwohl frühere Studien die mitochondriale Isolierung mittels Differentialzentrifugation dokumentiert haben15,16,17, wird im Folgenden ein kurzer Überblick über die Methoden der mobilen mitochondrialen Physiologie im Labor beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das mobile Labor für mitochondriale Physiologie ermöglicht es Forschern, Mitochondrien zu isolieren und die mitochondriale Atmungsrate innerhalb von 2 Stunden nach der Gewebeentnahme an entfernten Feldstandorten zu messen. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Messungen der mitochondrialen Atmung, die im AU MitoMobile durchgeführt wurden, mit Messungen in einem universitären Forschungslabor vergleichbar sind. Insbesondere sind die hier vorgestellten Werte für Zustand 3, Zustand 4 und RCR für wil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Mark Nelms und John Tennant von der Abteilung für Elektro- und Computertechnik des Samuel Ginn College of Engineering an der Auburn University für ihre Hilfe bei der strukturellen und elektrischen Ausstattung des AU MitoMobile. Darüber hinaus würdigen die Autoren die Finanzierung für die Ausstattung des AU MitoMobile und die Forschung aus einem Stipendium des Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
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