פיתוח מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית למדידת אנרגיה מיטוכונדריאלית בתחום
Summary
תכננו ובנינו מעבדה ניידת למדידת קצב הנשימה במיטוכונדריה מבודדת של חיות בר שנלכדו בשדות. כאן, אנו מתארים את העיצוב וההתאמה של מעבדה מיטוכונדריאלית ניידת ואת פרוטוקולי המעבדה הקשורים.
Abstract
אנרגיה מיטוכונדריאלית היא נושא מרכזי בביוכימיה ובפיזיולוגיה של בעלי חיים, כאשר חוקרים משתמשים בנשימה מיטוכונדריאלית כמדד לחקר היכולת המטבולית. כדי להשיג את המדדים של נשימה מיטוכונדריאלית, יש להשתמש בדגימות ביולוגיות טריות, ויש להשלים את כל הליך המעבדה תוך כשעתיים. יתר על כן, חלקים מרובים של ציוד מיוחד נדרשים לבצע בדיקות מעבדה אלה. הדבר יוצר אתגר למדידת נשימה מיטוכונדריאלית ברקמות של חיות בר החיות הרחק ממעבדות פיזיולוגיות, שכן רקמות חיות אינן יכולות להישמר זמן רב לאחר האיסוף בשטח. יתר על כן, הובלת בעלי חיים למרחקים ארוכים גורמת ללחץ, אשר יכול לשנות את האנרגיה המיטוכונדריאלית.
כתב יד זה מציג את MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU), מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שניתן לקחת לשטח ולהשתמש בה באתר כדי למדוד את חילוף החומרים במיטוכונדריה ברקמות שנאספו מחיות בר. התכונות הבסיסיות של המעבדה הניידת והשיטות שלב אחר שלב למדידת שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מבודדים מוצגים. בנוסף, הנתונים שהוצגו מאמתים את ההצלחה של התאמת המעבדה הניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית וביצוע מדידות נשימה מיטוכונדריאלית. החידוש של המעבדה הניידת טמון ביכולת לנסוע לשדה ולבצע מדידות מיטוכונדריאליות על רקמות של בעלי חיים שנלכדו באתר.
Introduction
עד כה, מחקרים שנועדו למדוד אנרגיה מיטוכונדריאלית הוגבלו לחיות מעבדה או לבעלי חיים שנלכדו ליד מעבדות פיזיולוגיות מבוססות, מה שמנע ממדענים לבצע מחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים ברקמות שנאספו מבעלי חיים במהלך פעילויות כגון נדידה, צלילה ותרדמת חורף 1,2,3,4,5,6 . בעוד שחוקרים רבים מדדו בהצלחה את קצב חילוף החומרים הבסיסי והשיא ואת הוצאות האנרגיה היומיות של חיות בר7,8, יכולתם של החוקרים למדוד את ביצועי המיטוכונדריה נותרה מוגבלת (אך ראו 1,4,9). זאת, בין היתר, בשל הצורך ברקמה טרייה לבידוד מיטוכונדריה ובמתקן מעבדה לביצוע הבידודים בתוך כשעתיים מקבלת הרקמה הטרייה. לאחר בידוד המיטוכונדריה, יש להשלים גם את מדידות הנשימה המיטוכונדריאלית תוך ~1 שעות.
קצבי נשימה מיטוכונדריאליים מבודדים מבוצעים בדרך כלל על ידי מדידת ריכוז החמצן במיכל אטום המחובר לאלקטרודת קלארק. התיאוריה מאחורי שיטה זו מבוססת על התצפית הבסיסית כי חמצן הוא מקבל האלקטרונים האחרון של נשימה מיטוכונדריאלית במהלך זרחן חמצוני. לכן, כאשר ריכוז החמצן יורד במהלך ניסוי, ההנחה היא כי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) מתרחש10. חמצן נצרך הוא פרוקסי עבור ATP המיוצר. חוקרים יכולים ליצור תנאי ניסוי ספציפיים באמצעות מצעים שונים וליזום נשימה מגורה אדנוזין דיפוספט (ADP) (מצב 3) על ידי הוספת כמויות קבועות מראש של ADP לחדר. בעקבות הזרחן של ADP אקסוגני ל-ATP, קצב צריכת החמצן יורד, ומגיעים למצב 4 וניתן למדוד אותו. יתר על כן, הוספת מעכבים ספציפיים מאפשרת לקבל מידע לגבי נשימה דולפת ונשימה לא מצומדת10. היחס בין מצב 3 למצב 4 קובע את יחס בקרת הנשימה (RCR), שהוא האינדיקטור לצימוד מיטוכונדריאלי כולל10,11. ערכים נמוכים יותר של RCR מצביעים על תפקוד לקוי כללי של המיטוכונדריה, בעוד שערכי RCR גבוהים יותר מצביעים על מידה רבה יותר של צימוד מיטוכונדריאלי10.
כאמור, איסוף החומר הביולוגי, בידוד המיטוכונדריה ומדידת קצב הנשימה חייבים להסתיים תוך שעתיים מקבלת הרקמה. כדי לבצע משימה זו מבלי להעביר בעלי חיים למרחקים גדולים למעבדות מבוססות, נבנתה מעבדה ניידת לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית שתילקח לאתרי שדה שבהם ניתן לאסוף נתונים אלה. רכב פנאי של ג’ייקו רדהוק משנת 2018 הוסב למעבדה ניידת לפיזיולוגיה מולקולרית ונקרא MitoMobile של אוניברסיטת אובורן (AU) (איור 1A). רכב פנאי נבחר בגלל המקרר המובנה, המקפיא, מיכל אגירת המים והצנרת, חשמל המופעל על ידי סוללות 12 וולט, גנרטור גז, מיכל פרופאן ומערכת פילוס עצמי. יתר על כן, רכב הפנאי מספק את היכולת לשהות באתרים מרוחקים למשך הלילה לצורך איסוף נתונים. חזית הרכב לא שונתה והיא מספקת את מגורי הנסיעה והשינה (איור 1B). אביזרי חדר השינה שהותקנו בעבר (מיטה, טלוויזיה וארון) בחלק האחורי של הרכב והכיריים הוסרו.
מדפי נירוסטה בהתאמה אישית ומשטח קוורץ בהתאמה אישית הנתמך על ידי מסגרת אלומיניום 80/20 הותקנו במקום אביזרי השינה והכיריים (איור 1C). ספסלי המעבדה מספקים מספיק מקום לאיסוף נתונים (איור 1D). צריכת החשמל של כל פריט ציוד (כלומר, צנטריפוגות קירור, תאי נשימה מיטוכונדריאליים, קוראי צלחות, מחשבים, הומוגנייזרים, מאזניים, אולטרה-מקפיא נייד וציוד מעבדה כללי אחר) נלקחה בחשבון. כדי לתמוך בדרישות המתח והזרם הגדולות של הצנטריפוגה, שודרגה מערכת החשמל לזו של ציוד ברמת מטוסים. תא חיצוני בחלקו האחורי של הרכב הוסב למפרץ אחסון חנקן נוזלי, העומד בהנחיות משרד התחבורה האמריקאי לאחסון ושינוע חנקן נוזלי. יחידת אחסון זו נבנתה מפלדת אל-חלד ויש לה אוורור מתאים כדי למנוע דליפת גז חנקן מתפשט לתא הנוסעים ברכב.
כדי לאשר שהמעבדה הניידת יכולה לשמש במחקרים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים, בודדו מיטוכונדריה, ונמדדו שיעורי נשימה מיטוכונדריאלית מעכברי בית פראיים (Mus musculus) שרירי השלד האחוריים. מכיוון ששריר Mus הוא אורגניזם מודל, שיעורי הנשימה המיטוכונדריאלית של מין זה מבוססים היטב12,13,14. למרות שמחקרים קודמים תיעדו בידוד מיטוכונדריאלי באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית15,16,17, סקירה קצרה של השיטות המשמשות בשיטות המעבדה הניידות לפיזיולוגיה מיטוכונדריאלית מתוארת להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
המעבדה הניידת לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה מאפשרת לחוקרים לבודד מיטוכונדריה ולמדוד את קצב הנשימה המיטוכונדריאלית תוך שעתיים מאיסוף הרקמה באתרי שדה מרוחקים. התוצאות המוצגות כאן מצביעות על כך שמדידות של נשימה מיטוכונדריאלית שנעשו ב- AU MitoMobile דומות למדידות שנעשו במעבדת מחקר באוניברסיטה. בא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למארק נלמס וג’ון טננט מהמחלקה להנדסת חשמל ומחשבים במכללת סמואל גין להנדסה באוניברסיטת אובורן על עזרתם בציוד המבני והחשמלי של AU MitoMobile. בנוסף, המחברים מודים על המימון להלבשת AU MitoMobile ומחקר ממענק הפרסים הנשיאותיים של אוניברסיטת אובורן למחקר בינתחומי (PAIR).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
