क्षेत्र में माइटोकॉन्ड्रियल एनर्जेटिक को मापने के लिए एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला का विकास
Summary
हमने क्षेत्र स्थानों पर पकड़े गए जंगली जानवरों के पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में श्वसन दर को मापने के लिए एक मोबाइल प्रयोगशाला का डिजाइन और निर्माण किया। यहां, हम एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल प्रयोगशाला और संबंधित प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के डिजाइन और आउटफिटिंग का वर्णन करते हैं।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान पशु जैव रसायन और शरीर विज्ञान में एक केंद्रीय विषय है, जिसमें शोधकर्ता चयापचय क्षमता की जांच के लिए मीट्रिक के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का उपयोग करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के उपायों को प्राप्त करने के लिए, ताजा जैविक नमूनों का उपयोग किया जाना चाहिए, और पूरी प्रयोगशाला प्रक्रिया लगभग 2 घंटे के भीतर पूरी होनी चाहिए। इसके अलावा, इन प्रयोगशाला परखों को करने के लिए विशेष उपकरणों के कई टुकड़ों की आवश्यकता होती है। यह शरीर विज्ञान प्रयोगशालाओं से दूर रहने वाले जंगली जानवरों के ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने के लिए एक चुनौती बनाता है क्योंकि क्षेत्र में संग्रह के बाद जीवित ऊतक को बहुत लंबे समय तक संरक्षित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, लंबी दूरी पर जीवित जानवरों का परिवहन तनाव को प्रेरित करता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान को बदल सकता है।
यह पांडुलिपि ऑबर्न यूनिवर्सिटी (एयू) मिटोमोबाइल का परिचय देती है, जो एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला है जिसे क्षेत्र में ले जाया जा सकता है और जंगली जानवरों से एकत्र किए गए ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय को मापने के लिए साइट पर उपयोग किया जा सकता है। मोबाइल प्रयोगशाला की बुनियादी विशेषताएं और पृथक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापने के लिए चरण-दर-चरण विधियां प्रस्तुत की जाती हैं। इसके अतिरिक्त, प्रस्तुत डेटा मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला को फिट करने और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप बनाने की सफलता को मान्य करता है। मोबाइल प्रयोगशाला की नवीनता क्षेत्र में ड्राइव करने और साइट पर कैप्चर किए गए जानवरों के ऊतकों पर माइटोकॉन्ड्रियल माप करने की क्षमता में निहित है।
Introduction
आज तक, माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जावान को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए अध्ययन प्रयोगशाला जानवरों या स्थापित फिजियोलॉजी प्रयोगशालाओं के पास पकड़े गए जानवरों तक सीमित हैं, जिसने वैज्ञानिकों को प्रवासन, डाइविंग और हाइबरनेशन 1,2,3,4,5,6 जैसी गतिविधियों के दौरान जानवरों से एकत्र किए गए ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक अध्ययन करने से रोक दिया है।. जबकि कई जांचकर्ताओं ने जंगली जानवरों के बेसल और पीक चयापचय दर और दैनिक ऊर्जा व्ययको सफलतापूर्वक मापा है 7,8, माइटोकॉन्ड्रिया के प्रदर्शन को मापने के लिए शोधकर्ताओं की क्षमता सीमित रही है (लेकिनदेखें 1,4,9). यह आंशिक रूप से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के लिए ताजा ऊतक की आवश्यकता और ताजा ऊतक प्राप्त करने के लगभग 2 घंटे के भीतर अलगाव करने के लिए एक प्रयोगशाला सुविधा के कारण है। एक बार माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन माप भी ~ 1 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
पृथक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर आमतौर पर क्लार्क इलेक्ट्रोड से जुड़े एक सील कंटेनर में ऑक्सीजन एकाग्रता को मापकर की जाती है। इस विधि के पीछे सिद्धांत बुनियादी अवलोकन पर स्थापित है कि ऑक्सीजन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के दौरान माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है। इसलिए, जैसा कि एक प्रयोग के दौरान ऑक्सीजन एकाग्रता गिरती है, यह माना जाता है कि एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन10 होता है। खपत ऑक्सीजन उत्पादित एटीपी के लिए एक प्रॉक्सी है। शोधकर्ता विभिन्न सब्सट्रेट्स का उपयोग करके विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियां बना सकते हैं और कक्ष में एडीपी की पूर्व निर्धारित मात्रा को जोड़कर एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) -उत्तेजित श्वसन (राज्य 3) शुरू कर सकते हैं। एक्सोजेनस एडीपी से एटीपी के फॉस्फोराइलेशन के बाद, ऑक्सीजन की खपत दर कम हो जाती है, और राज्य 4 तक पहुंच जाता है और इसे मापा जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट अवरोधकों के अलावा रिसाव श्वसन और अयुग्मित श्वसन के बारे मेंजानकारी प्राप्त करने की अनुमति देता है। राज्य 3 से राज्य 4 का अनुपात श्वसन नियंत्रण अनुपात (आरसीआर) निर्धारित करता है, जो समग्र माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन10,11 का संकेतक है। आरसीआर के निम्न मान समग्र माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता का संकेत देते हैं, जबकि उच्च आरसीआर मान माइटोकॉन्ड्रियल युग्मन10 की अधिक सीमा का सुझाव देते हैं।
जैसा कि पहले कहा गया है, जैविक सामग्री का संग्रह, माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव, और श्वसन दर का माप ऊतक प्राप्त करने के 2 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। स्थापित प्रयोगशालाओं में बड़ी दूरी पर जानवरों को परिवहन किए बिना इस कार्य को पूरा करने के लिए, एक मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला का निर्माण क्षेत्र स्थानों पर ले जाने के लिए किया गया था जहां इन आंकड़ों को एकत्र किया जा सकता है। एक 2018 जेको रेडहॉक मनोरंजक वाहन को एक मोबाइल आणविक शरीर विज्ञान प्रयोगशाला में परिवर्तित कर दिया गया था और इसका नाम ऑबर्न यूनिवर्सिटी (एयू) मिटोमोबाइल (चित्रा 1 ए) रखा गया था। एक मनोरंजक वाहन का चयन अंतर्निहित रेफ्रिजरेटर, फ्रीजर, जल भंडारण टैंक और नलसाजी, 12-वोल्ट बैटरी, गैस जनरेटर, प्रोपेन टैंक और स्व-स्तरीय प्रणाली द्वारा संचालित बिजली के कारण किया गया था। इसके अलावा, मनोरंजक वाहन डेटा संग्रह के लिए रात भर दूरस्थ साइटों पर रहने की क्षमता प्रदान करता है। वाहन के सामने के हिस्से को नहीं बदला गया था और ड्राइविंग और स्लीपिंग क्वार्टर प्रदान करता है (चित्रा 1 बी)। पहले वाहन के पीछे और स्टोवटॉप में स्थापित बेडरूम सुविधाएं (बिस्तर, टीवी और कैबिनेट) को हटा दिया गया था।
कस्टम-निर्मित स्टेनलेस-स्टील शेल्विंग और 80/20 एल्यूमीनियम फ्रेमिंग द्वारा समर्थित एक कस्टम क्वार्ट्ज काउंटरटॉप बेडरूम सुविधाओं और स्टोवटॉप (चित्रा 1 सी) के स्थान पर स्थापित किए गए थे। प्रयोगशाला बेंच डेटा संग्रह के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करती हैं (चित्रा 1 डी)। उपकरण के प्रत्येक टुकड़े (यानी, प्रशीतित सेंट्रीफ्यूज, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन कक्ष, प्लेट रीडर, कंप्यूटर, होमोजिनाइज़र, तराजू, पोर्टेबल अल्ट्रा-फ्रीजर, और अन्य सामान्य प्रयोगशाला आपूर्ति) की बिजली की खपत को ध्यान में रखा गया था। सेंट्रीफ्यूज के बड़े वोल्टेज और वर्तमान मांगों का समर्थन करने के लिए, विद्युत प्रणाली को विमान-ग्रेड उपकरण में अपग्रेड किया गया था। वाहन के पीछे एक बाहरी डिब्बे को तरल नाइट्रोजन भंडारण खाड़ी में परिवर्तित कर दिया गया था, जो तरल नाइट्रोजन भंडारण और परिवहन के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के परिवहन विभाग के दिशानिर्देशों को पूरा करता है। इस भंडारण इकाई का निर्माण स्टेनलेस स्टील के साथ किया गया था और इसमें वाहन के यात्री डिब्बे में किसी भी विस्तारित नाइट्रोजन गैस को लीक करने से रोकने के लिए उचित वेंटिंग है।
यह पुष्टि करने के लिए कि मोबाइल प्रयोगशाला का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक अध्ययनों में किया जा सकता है, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग किया गया था, और जंगली-व्युत्पन्न घर चूहों (मस मस्कुलस) हिंदलिम्ब कंकाल की मांसपेशी से माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापा गया था। क्योंकि मस मस्कुलस एक मॉडल जीव है, इस प्रजाति की माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर अच्छी तरह से स्थापित12,13,14 है। यद्यपि पिछले अध्ययनों ने अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन15,16,17 के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव का दस्तावेजीकरण किया है, मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला विधियों में उपयोग किए जाने वाले तरीकों का एक संक्षिप्त अवलोकन नीचे वर्णित है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मोबाइल माइटोकॉन्ड्रियल फिजियोलॉजी प्रयोगशाला शोधकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने और दूरस्थ क्षेत्र साइटों पर ऊतक संग्रह के 2 घंटे के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को मापने में सक्षम बनाती है…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने एयू मिटोमोबाइल के संरचनात्मक और विद्युत आउटफिटिंग में मदद करने के लिए ऑबर्न विश्वविद्यालय में सैमुअल गिन कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग के इलेक्ट्रिकल और कंप्यूटर इंजीनियरिंग विभाग से मार्क नेल्म्स और जॉन टेनेंट को स्वीकार किया। इसके अतिरिक्त, लेखक एयू मिटोमोबाइल को तैयार करने और अंतःविषय अनुसंधान (पेयर) अनुदान के लिए ऑबर्न यूनिवर्सिटी प्रेसिडेंशियल अवार्ड्स से शोध के लिए धन स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
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