ミトコンドリアのエネルギーを野外で測定するための移動式ミトコンドリア生理学研究室の開発
Summary
野外で捕獲した野生動物の単離ミトコンドリアの呼吸数を測定する移動実験室を設計・建設しました。ここでは、移動式ミトコンドリアラボの設計と装備、および関連するラボプロトコルについて説明します。
Abstract
ミトコンドリアのエネルギー学は、動物の生化学と生理学の中心的なテーマであり、研究者はミトコンドリア呼吸を代謝能力を調査するための指標として使用しています。ミトコンドリア呼吸の測定値を得るには、新鮮な生物学的サンプルを使用する必要があり、実験室手順全体を約2時間以内に完了する必要があります。さらに、これらのラボアッセイを実行するには、複数の専用機器が必要です。そのため、生理学研究室から遠く離れた場所に生息する野生動物の組織におけるミトコンドリア呼吸を測定することは、野外で採取した後、生きた組織を長期間保存することができないため、困難が生じます。さらに、生きた動物を長距離輸送するとストレスが誘発され、ミトコンドリアのエネルギーが変化する可能性があります。
この原稿では、オーバーン大学(AU)のMitoMobileという、野生動物から採取した組織のミトコンドリア代謝を測定するために現場に持ち込んで現場で使用できる移動式ミトコンドリア生理学研究室を紹介します。移動式実験室の基本的な特徴と、孤立したミトコンドリアの呼吸数を測定するための段階的な方法を紹介します。さらに、提示されたデータは、移動式ミトコンドリア生理学実験室の装備とミトコンドリア呼吸測定の成功を検証しています。移動式ラボの斬新さは、現場に車で行き、現場で捕獲された動物の組織でミトコンドリア測定を行うことができることです。
Introduction
今日まで、ミトコンドリアのエネルギーを測定するために設計された研究は、実験動物または確立された生理学研究所の近くで捕獲された動物に限定されており、科学者は、移動、潜水、冬眠などの活動中に動物から収集された組織でミトコンドリア生体エネルギー研究を行うことを妨げてきました1,2,3,4,5,6 .多くの研究者が野生動物の基礎代謝率とピーク代謝率、および毎日のエネルギー消費量の測定に成功していますが7,8、ミトコンドリアのパフォーマンスを測定する研究者の能力は限られています(ただし、1,4,9を参照)。これは、ミトコンドリアを単離するための新鮮な組織と、新鮮な組織を入手してから約2時間以内に単離を行うための実験施設が必要であることが一因です。ミトコンドリアが分離されたら、ミトコンドリア呼吸の測定も~1時間以内に完了する必要があります。
単離されたミトコンドリア呼吸速度は、通常、クラーク電極に接続された密閉容器内の酸素濃度を測定することによって行われます。この方法の背後にある理論は、酸素が酸化的リン酸化中のミトコンドリア呼吸の最後の電子受容体であるという基本的な観察に基づいています。したがって、実験中に酸素濃度が下がると、アデノシン三リン酸(ATP)の生成が起こると仮定される10。消費された酸素は、産生されたATPの代理です。研究者は、さまざまな基質を使用して特定の実験条件を作成し、チャンバーに所定の量のADPを添加することにより、アデノシン二リン酸(ADP)刺激呼吸(状態3)を開始できます。外因性ADPからATPへのリン酸化に続いて、酸素消費率は低下し、状態4に達して測定可能になる。さらに、特異的阻害剤の添加により、漏出呼吸および非結合呼吸に関する情報を得ることができる10。状態3と状態4の比率は、ミトコンドリア全体の結合の指標である呼吸制御比(RCR)を決定する10,11。RCRの値が低いほどミトコンドリア全体の機能不全を示し、RCRの値が高いほどミトコンドリアの結合の程度が大きいことを示唆している10。
前述したように、生体物質の採取、ミトコンドリアの単離、および呼吸数の測定は、組織を取得してから2時間以内に完了する必要があります。動物を既存の研究所に長距離輸送することなくこのタスクを達成するために、移動式ミトコンドリア生理学実験室が建設され、これらのデータを収集できるフィールドの場所に連れて行かれました。2018年のJayco RedhawkRV車は、移動式分子生理学研究所に改造され、オーバーン大学(AU)MitoMobileと名付けられました (図1A)。冷蔵庫、冷凍庫、貯水タンクと配管、12ボルトのバッテリーで駆動する電気、ガス発電機、プロパンタンク、セルフレベリングシステムを備えたRV車が選ばれました。さらに、RV車は、データ収集のために遠隔地に一晩滞在する機能を提供します。車両の前部は変更されておらず、運転室と寝室があります (図1B)。車両後部に設置されていた寝室のアメニティ(ベッド、テレビ、キャビネット)とコンロは撤去されました。
寝室のアメニティとコンロの代わりに、特注のステンレス製の棚と80/20アルミニウムフレームで支えられた特注のクォーツカウンタートップが設置されました (図1C)。実験台は、データ収集に十分なスペースを提供します (図1D)。各機器(冷蔵遠心分離機、ミトコンドリア呼吸室、プレートリーダー、コンピューター、ホモジナイザー、体重計、ポータブル超冷凍庫、その他の一般的な実験用品)の消費電力を考慮しました。遠心分離機の大きな電圧と電流の要求に対応するために、電気系統は航空機グレードの機器にアップグレードされました。車両後部の外部コンパートメントは、液体窒素の貯蔵と輸送に関する米国運輸省のガイドラインを満たす液体窒素貯蔵ベイに改造されました。この貯蔵ユニットはステンレス鋼で構成されており、膨張する窒素ガスが車両の客室に漏れるのを防ぐための適切な通気孔を備えています。
移動実験室がミトコンドリア生体エネルギー研究に利用できることを確認するために、ミトコンドリアを単離し、野生由来のハツカネズミ(Mus musculus)の後肢骨格筋のミトコンドリア呼吸数を測定しました。Mus musculusはモデル生物であるため、この種のミトコンドリア呼吸数は12,13,14と確立されています。以前の研究では、差動遠心分離によるミトコンドリアの分離が文書化されていますが15,16,17、モバイルミトコンドリア生理学実験室法で使用される方法の簡単な概要を以下に説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
移動式ミトコンドリア生理学ラボでは、研究者がミトコンドリアを分離し、遠隔地での組織採取から2時間以内にミトコンドリア呼吸数を測定することができます。本研究で得られた結果は、AU MitoMobileで行われたミトコンドリア呼吸の測定値が、大学の研究室で行われた測定に匹敵することを示唆しています。具体的には、ここで示した野生由来のMus musculusの状態3、状態4、およびRCRの…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、AU MitoMobileの構造および電気艤装を支援してくれたオーバーン大学サミュエル・ジン・カレッジ・オブ・エンジニアリングの電気・コンピュータ工学科のマーク・ネルムス氏とジョン・テナント氏に感謝の意を表します。さらに、著者らは、AU MitoMobileに装備するための資金と、オーバーン大学学際的研究のための大統領賞(PAIR)助成金からの研究を認めています。
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
