Utvikling av et mobilt mitokondriefysiologisk laboratorium for måling av mitokondriell energetikk i felt
Summary
Vi designet og konstruerte et mobilt laboratorium for å måle respirasjonsfrekvenser i isolerte mitokondrier av ville dyr fanget på feltsteder. Her beskriver vi design og utrustning av et mobilt mitokondrielaboratorium og tilhørende laboratorieprotokoller.
Abstract
Mitokondriell energetikk er et sentralt tema i dyrebiokjemi og fysiologi, med forskere som bruker mitokondriell respirasjon som en beregning for å undersøke metabolsk evne. For å oppnå målinger av mitokondriell respirasjon, må ferske biologiske prøver brukes, og hele laboratorieprosedyren må fullføres innen ca. 2 timer. Videre kreves det flere deler av spesialutstyr for å utføre disse laboratorieanalysene. Dette skaper en utfordring for å måle mitokondriell respirasjon i vev hos ville dyr som lever langt fra fysiologiske laboratorier, da levende vev ikke kan bevares veldig lenge etter innsamling i felt. Videre induserer transport av levende dyr over lange avstander stress, noe som kan endre mitokondriell energi.
Dette manuskriptet introduserer Auburn University (AU) MitoMobile, et mobilt mitokondrielt fysiologisk laboratorium som kan tas inn i feltet og brukes på stedet for å måle mitokondriell metabolisme i vev samlet fra ville dyr. De grunnleggende funksjonene i det mobile laboratoriet og trinnvise metoder for måling av isolerte mitokondrielle respirasjonshastigheter presenteres. I tillegg bekrefter dataene som presenteres suksessen med å utstyre det mobile mitokondriefysiologiske laboratoriet og gjøre mitokondrielle respirasjonsmålinger. Nyheten til det mobile laboratoriet ligger i evnen til å kjøre til feltet og utføre mitokondrielle målinger på vev av dyr fanget på stedet.
Introduction
Hittil har studier designet for å måle mitokondriell energetikk vært begrenset til laboratoriedyr eller dyr fanget nær etablerte fysiologiske laboratorier, noe som utelukket forskere fra å utføre mitokondrielle bioenergetiske studier i vev samlet fra dyr under slike aktiviteter som migrasjon, dykking og dvalemodus 1,2,3,4,5,6 . Mens mange etterforskere har målt basale og topp metabolske hastigheter og daglige energiforbruk av ville dyr7,8, har forskernes kapasitet til å måle ytelsen til mitokondrier vært begrenset (men se 1,4,9). Dette skyldes delvis behovet for ferskt vev for å isolere mitokondrier og et laboratorieanlegg for å utføre isolasjonene innen ca. 2 timer etter å ha oppnådd det friske vevet. Når mitokondriene er isolert, bør mitokondrielle respirasjonsmålinger også fullføres innen ~ 1 time.
Isolerte mitokondrielle respirasjonshastigheter utføres vanligvis ved å måle oksygenkonsentrasjonen i en forseglet beholder koblet til en Clark-elektrode. Teorien bak denne metoden er basert på den grunnleggende observasjonen at oksygen er den siste elektronakseptoren av mitokondriell respirasjon under oksidativ fosforylering. Derfor, når oksygenkonsentrasjonen faller under et eksperiment, antas det at adenosintrifosfat (ATP) produksjon oppstår10. Forbrukt oksygen er en proxy for produsert ATP. Forskere kan lage spesifikke eksperimentelle forhold ved hjelp av forskjellige substrater og initiere adenosindifosfat (ADP) -stimulert respirasjon (tilstand 3) ved å legge til forhåndsbestemte mengder ADP til kammeret. Etter fosforyleringen av den eksogene ADP til ATP, reduseres oksygenforbruket, og tilstand 4 nås og kan måles. Videre gjør tilsetning av spesifikke hemmere det mulig å få informasjon om lekkasjerespirasjon og frakoblet respirasjon10. Forholdet mellom tilstand 3 og tilstand 4 bestemmer respiratorisk kontrollforhold (RCR), som er indikatoren for total mitokondriell kobling10,11. Lavere verdier av RCR indikerer total mitokondriell dysfunksjon, mens høyere RCR-verdier antyder større grad av mitokondriekobling10.
Som tidligere nevnt må innsamling av biologisk materiale, mitokondriell isolasjon og måling av respirasjonshastigheter fullføres innen 2 timer etter at vev er oppnådd. For å utføre denne oppgaven uten å transportere dyr over store avstander til etablerte laboratorier, ble et mobilt mitokondriefysiologisk laboratorium konstruert for å bli tatt til feltsteder hvor disse dataene kan samles inn. Et 2018 Jayco Redhawk fritidskjøretøy ble omgjort til et mobilt molekylærfysiologilaboratorium og kalt Auburn University (AU) MitoMobile (figur 1A). Et fritidskjøretøy ble valgt på grunn av det innebygde kjøleskapet, fryseren, vannlagringstanken og rørleggerarbeidet, strøm drevet av 12-volts batterier, gassgenerator, propantank og selvnivelleringssystem. Videre gir fritidskjøretøyet muligheten til å bo på avsidesliggende steder over natten for datainnsamling. Fronten på kjøretøyet ble ikke endret og gir kjøre- og sovekvarter (figur 1B). Tidligere installerte soveromsfasiliteter (seng, TV og skap) bak på kjøretøyet og komfyrtoppen ble fjernet.
Skreddersydde hyller i rustfritt stål og en tilpasset benkeplate i kvarts støttet av 80/20 aluminiumsinnramming ble installert i stedet for soverommets fasiliteter og komfyrtopp (figur 1C). Laboratoriebenkene gir tilstrekkelig plass til datainnsamling (figur 1D). Strømforbruket til hvert utstyr (dvs. nedkjølt sentrifuge, mitokondrielle respirasjonskamre, platelesere, datamaskiner, homogenisatorer, vekter, bærbar ultrafryser og andre generelle laboratorieforsyninger) ble tatt i betraktning. For å støtte sentrifugens store spennings- og strømbehov ble det elektriske systemet oppgradert til utstyr i flykvalitet. Et eksternt rom bak på kjøretøyet ble omgjort til et lagringsrom for flytende nitrogen, som oppfyller USAs transportdepartements retningslinjer for lagring og transport av flytende nitrogen. Denne lagringsenheten ble konstruert med rustfritt stål og har riktig ventilasjon for å forhindre at ekspanderende nitrogengass lekker inn i kupeen på kjøretøyet.
For å bekrefte at det mobile laboratoriet kan brukes i mitokondrielle bioenergetiske studier, ble mitokondrier isolert, og mitokondrielle respirasjonshastigheter fra villavledede husmus (Mus musculus) baklemmemuskulatur ble målt. Fordi Mus musculus er en modellorganisme, er mitokondriell respirasjonsfrekvens av denne arten veletablert12,13,14. Selv om tidligere studier har dokumentert mitokondriell isolering via differensialsentrifugering15,16,17, er en kort oversikt over metodene som brukes i de mobile mitokondriefysiologiske laboratoriemetodene beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mobile mitokondriefysiologiske laboratoriet gjør det mulig for forskere å isolere mitokondrier og måle mitokondriell respirasjonshastighet innen 2 timer etter vevsinnsamling på avsidesliggende feltsteder. Resultatene som presenteres her tyder på at målinger av mitokondriell respirasjon gjort i AU MitoMobile er sammenlignbare med målinger gjort i et universitetsforskningslaboratorium. Spesielt er verdiene for tilstand 3, tilstand 4 og RCR for villavledet muskulus presentert her sammenlignbare med tidli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner Nelms og John Tennant fra avdelingen for elektroteknikk og datateknikk ved Samuel Ginn College of Engineering ved Auburn University for å hjelpe til med strukturell og elektrisk utrustning av AU MitoMobile. I tillegg anerkjenner forfatterne finansieringen for å utstyre AU MitoMobile og forskning fra et Auburn University Presidential Awards for tverrfaglig forskning (PAIR) stipend.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
